曾雪芳
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
- 供职机构：中南大学湘雅二医院更多>>
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- 高产尿酸氧化酶乳酸工程菌的构建
- 2015年
- 目的 将尿酸氧化酶基因克隆到乳酸乳球菌（Llactis）NZ9000中,使之能启动nisA放大系统增加尿酸氧化酶活性,构建一株高效分解尿酸的基因工程菌.方法 根据GenBank上已知的产朊假丝酵母菌尿酸氧化酶基因序列（Uricase,E12709）设计引物,PCR扩增尿酸氧化酶基因片段,将其克隆入质粒PNZ8048、PMG36e,构建重组质粒PNZ8048-U、PMG36e-U,重组质粒电转化L.lactis NZ9000构建基因工程菌L.lactis NZ9000-PNZ8048-U、L.lactis NZ9000-PMG36e-U,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定重组菌体裂解液中的尿酸氧化酶,测定尿酸氧化酶的活性和在高尿酸患者血清中降解尿酸的能力.结果 构建的重组质粒PNZ8048-U、PMG36e-U经酶切和测序显示,尿酸氧化酶基因片段长度为0.9 kb,基因片段序列与GenBank上尿酸氧化酶基因序列完全一致.构建重组基因工二程菌L.lactis NZ9000-PNZ8048-U、L.lactis NZ9000-PMG36e-U,均表达相对分子质量约为34 000的重组蛋白,与从尿酸氧化酶基因序列推测的303个氨基酸的理论分子量相符.体外测定菌酶液活性,L.lactis NZ9000-PNZ8048-U组酶活性为（1.92±0.14）u/ml,产朊假丝酵母菌组酶活性为（0.55±0.05）u/ml,L.lactis NZ9000-PMG36e-U组酶活性为（0.29±0.06） u/ml.高尿酸血症患者血清培养结果显示加入生理盐水的对照组尿酸值（620.0±58.7） μmol/L,L.lactis NZ9000-PNZ8048-U组（321.0±46.2） μmol/L,L.lactis NZ9000-PMG36e-U组（568.0±47.3）μmol/L,产朊假丝酵母菌组（406.0±42.4）μmol/L,其他3组与对照组比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.结论 成功构建基因工程菌L.lactis NZ9000-PNZ8048-U,重组菌酶活性较基因来源菌产朊假丝酵母菌高,并可高效分解高尿酸患者血清中的尿酸.
- 张彦新曾雪芳刘芳蒋云生
- 关键词：乳酸乳球菌尿酸氧化酶质粒
