刘青涛
- 作品数：60 被引量：86H指数：5
- 供职机构：江苏省农业科学院更多>>
- 发文基金：江苏省农业科技自主创新基金国家自然科学基金江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- 一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗及其构建方法和应用
- 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种同时表达FAdV‑4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明设计特异性引物，利用重叠PCR扩增技术，将FAdV‑4的纤突蛋白1与纤突蛋白2基因通过2A肽基因...
- 刘青涛李银杨婧黄欣梅赵冬敏韩凯凯刘宇卓章丽娇
- 文献传递
- 坦布苏病毒感染诱导雏鸭体内未折叠蛋白反应被引量：1
- 2021年
- 【目的】检测坦布苏病毒在雏鸭体内诱导未折叠蛋白反应的信号通路(PERK、IRE1和ATF6),为揭示坦布苏病毒致病机制提供理论基础。【方法】取1日龄SPF雏鸭,腹腔接种坦布苏病毒(JS804株),于接种后12、24、36和48 h从对照组和攻毒组各取5只剖杀,分别取肝脏、心脏和脑组织,利用组织总RNA提取试剂盒提取各个组织样品总RNA,反转录获得cDNA。根据未折叠蛋白反应的3条信号通路,选取不同通路中的标志性分子,设计合成特异性引物,利用荧光定量PCR方法检测靶基因。以GAPDH为内参基因,采用相对定量法(2-ΔΔCt),分析靶基因的表达水平。【结果】雏鸭肝脏中坦布苏病毒含量最高,心脏次之,脑最低。对未折叠蛋白反应标志性分子GRP78的检测结果显示,脑和肝脏中GRP78表达量持续升高,并在攻毒后36 h达到顶峰(4.21倍和10.14倍),心脏中GRP78表达量仅在攻毒后36 h短暂升高(1.32倍)。PERK信号通路标志性分子ATF4表达水平在肝脏和脑中分别从攻毒后24 h和36 h持续升高至攻毒后48 h,并在攻毒后36 h达到顶峰(2.71倍和6.02倍),心脏中ATF4的表达量则仅在攻毒后36 h时升高(1.57倍)。IRE1信号通路标志性分子XBP1s在肝脏中的表达量升高最为显著(9倍),而脑中EDEM的表达量升高最为显著(3.87倍)且持续时间最长(从攻毒后12 h至攻毒后48 h)。与对照组相比,ATF6信号通路标志性分子GRP94和XBP1u均出现升高现象,虽然两种蛋白在不同组织中表达量变化的时间点和趋势不同,但均在攻毒后36 h出现峰值。【结论】首次报道了坦布苏病毒感染可在雏鸭体内激活未折叠蛋白反应的3条信号通路,本研究将有助于深入研究坦布苏病毒与宿主之间的相互作用机制。
- 赵冬敏黄欣梅章丽娇刘青涛杨婧韩凯凯刘宇卓李银
- 关键词：内质网应激未折叠蛋白反应信号通路
- 坦布苏病毒囊膜蛋白诱导的小鼠免疫应答
- 2017年
- 为了研究坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的免疫原性,利用大肠杆菌表达系统高效表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并对其诱导小鼠免疫应答进行了研究。结果表明,E蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫组小鼠血清中抗体效价均可达1∶51 200以上;同时,E蛋白可显著诱导血清中细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达,免疫组小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均极显著高于对照组(P<0.01),IFN-γ含量则显著高于对照组(P<0.05);此外,与对照组相比,E蛋白还可极显著刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,上述结果表明,E蛋白免疫后,小鼠机体可产生显著的体液免疫和细胞免疫反应。攻毒保护性试验结果显示,攻毒后,经荧光定量RT-PCR检测,E蛋白免疫组小鼠脑、肝脏、脾脏、卵巢、肾脏中坦布苏病毒载量均显著低于对照组,表明免疫E蛋白可有效抑制坦布苏病毒在小鼠各个组织中的增殖。结果表明,大肠杆菌表达的坦布苏病毒E蛋白可作为坦布苏病毒亚单位疫苗的候选抗原,为进一步预防和控制坦布苏病毒病奠定理论基础。
- 赵冬敏黄欣梅韩凯凯刘宇卓杨婧刘青涛毕可然李银
- 关键词：囊膜蛋白免疫应答亚单位疫苗
- 基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用
- 本发明公开了基于RT‑RPA和CRISPR/Cas的DHAV‑1和DHAV‑3检测体系及应用，基于RT‑RPA和CRISPR/Cas的DHAV‑1和DHAV‑3检测体系包括RT‑RPA体系和CRISPR/Cas体系，RT...
- 吴凤瑶张小飞卢凤英刘青涛潘群兴孙华伟赵莎徐彬沈丽雅
- 一步法SYBR Green实时定量RT-PCR检测坦布苏病毒方法的建立被引量：7
- 2015年
- 为建立快速检测坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）的一步法SYBRGreen实时定量RT-PCR方法，本研究根据TMUVNS2A基因的保守序列，设计并合成了1对特异性引物，以体外转录的NS2A基因作为标准品，采用一步法实时定量RT-PCR方法检测TMUV。结果显示该方法标准曲线的决定系数为0．997，具有良好的线性关系；灵敏度为1ul10拷贝，是常规RT-PCR方法的100倍；并且与其他病毒无交叉反应，批内和批间变异系数分别为0．11％～0．30％和0．88％～1．31％，具有良好的特异性和稳定性。该方法对于TMUV人工感染鸭泄殖腔棉拭子的检测阳性率为100％，而常规RT-PCR检测的阳性率只有71％。因此，本研究所建立的一步法实时定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性、特异性好，可以用于TMUV的临床检测。
- 刘青涛李银赵冬敏刘宇卓黄欣梅杨婧韩凯凯安凤娇
- 关键词：实时定量RT-PCR
- 鸭坦布苏病毒病-H9亚型禽流感二联灭活疫苗免疫佐剂筛选被引量：3
- 2021年
- 为筛选出理想的鸭TMUV-AIV(H9亚型)二联灭活疫苗免疫佐剂,将灭活的坦布苏病毒液和禽流感病毒(H9亚型)尿囊液分别与白油佐剂、卡波姆佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂制成抗原含量相同的TMUV-AIV二联灭活疫苗。应用阻断ELISA方法和血凝抑制方法测定免疫鸭血清中坦布苏病毒和禽流感病毒抗体,比较不同佐剂疫苗对试验鸭的免疫效力。结果表明,以白油作为佐剂的灭活疫苗组免疫效果最好,抗体产生快、抗体水平优于其他各组,免疫2周后60%(6/10)血清样品HI抗体可达1∶8以上,80%血清样品呈TMUV抗体阳性,是制备鸭TMUV-AIV(H9亚型)二联灭活疫苗的理想佐剂。
- 田宇杰嵇辛勤章丽娇刘青涛韩凯凯杨婧刘宇卓赵冬敏刘娜王梦瑶李银
- 关键词：灭活疫苗
- 鸭坦布苏病毒RNA依赖RNA聚合酶的真核表达及生物信息学分析
- 2021年
- 旨在对鸭坦布苏病毒NS5蛋白功能基团RNA依赖RNA聚合酶进行真核表达,同时对其蛋白结构和功能进行生物信息学分析。首先查找GenBank数据库中收录的DTMUV基因序列,以RdRp基因为研究对象,通过软件设计并合成特异性引物,RT-PCR技术扩增RdRp基因,回收PCR产物并与pCMV-N-Flag真核表达载体相连接,构建真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp,将测序无误的质粒转染至BHK-21细胞,通过Western Blot和间接免疫荧光技术检测该蛋白在BHK-21细胞内的表达。同时针对RdRp蛋白,利用生物信息学软件进行序列分析、结构解析及功能预测。通过PCR方法成功扩增RdRp基因,构建的真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp经双酶切鉴定证明正确,进一步通过间接免疫荧光技术与Western Blot检测发现,重组质粒pCMV-Flag-RdRp在BHK-21细胞内正常表达,生物信息学分析发现,RdRp蛋白编码606个氨基酸,分子式为C_(3091)H_(4810)N_(870)O_(894)S_(41),编码蛋白亲水性平均系数为-0.536,不稳定指数为42.15,含有丰富的磷酸化位点及O-糖基化位点。其二级结构包含46.37%的α-螺旋、12.54%的延伸链以及35.31%的无规则卷曲。上述结果为进一步研究坦布苏病毒致病性打下了基础。
- 韩凯凯严若峰严若峰刘宇卓刘青涛刘宇卓李银章丽娇赵冬敏付晨
- 关键词：生物信息学
- 鸭坦布苏病毒甲基转移酶的真核表达及鉴定
- 2021年
- 甲基转移酶(methyltransferase,MTase)是鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白5的重要功能基团,在病毒复制及致病过程中发挥重要作用。为了对鸭坦布苏病毒甲基转移酶进行真核表达,并对其生物学功能进行鉴定,以GenBank中收录的DTMUV JS804株基因序列为模板,设计针对MTase的特异性引物,提取TMUV RNA,反转录得到cDNA,以其为模板进行扩增,得到MTase的基因片段,然后亚克隆至pCMV-Flag真核表达载体中,构建重组质粒pCMV-Flag-MTase,提取去除内毒素的重组质粒,并转染至BHK-21细胞,通过间接免疫荧光观察和Western Blot鉴定该蛋白的表达。结果显示,质粒pCMV-Flag-MTase经双酶切鉴定证明构建正确,通过间接免疫荧光与Western Blot检测,重组质粒在BHK-21细胞内正常表达,表达的蛋白与天然坦布苏病毒MTase具有相同的反应原性。
- 韩凯凯严若峰严若峰刘宇卓刘青涛刘宇卓李银杨婧
- 关键词：甲基转移酶真核表达
- 坦布苏病毒感染DF-1细胞入侵途径的初步研究被引量：1
- 2021年
- 坦布苏病毒是我国新发易引起家禽出现严重产蛋下降和中枢神经系统异常的重要传染病病原。通过特异性的化学阻断剂预处理DF-1细胞,噬斑计数法检测其对病毒滴度的影响,相对荧光定量RT-PCR检测其对病毒核酸表达的影响,并对影响显著的结果进行吸附和内吞试验。结果显示,网格蛋白抑制剂氯丙嗪和动力蛋白抑制剂dynasore可显著降低病毒滴度和病毒核酸表达,且主要作用于内吞过程,对病毒吸附无影响。胆固醇抽提剂甲基-β-环糊精、小窝蛋白抑制剂genistein及胞吞抑制剂EIPA对病毒滴度无明显影响。结果表明,坦布苏病毒入侵DF-1细胞依赖于网格蛋白和动力蛋白,而不依赖于胆固醇、小窝蛋白和胞吞作用。
- 章丽娇李银刘青涛刘宇卓韩凯凯赵冬敏黄欣梅杨婧
- 关键词：入侵
- 鸭圆环病毒ORF-C1基因的扩增及遗传进化分析
- 2023年
- 鸭圆环病毒(DuCV)感染能够引起鸭的免疫抑制,引起多种病原的继发性感染,在我国鸭群中广泛流行。为了解DuCV的遗传变异情况,对采自山东、江苏和贵州3个省份的19个鸭场的样品进行了PCR测定,并对DuCV的ORF-C1基因进行测序和遗传进化分析。PCR测定结果显示,19个鸭场中有9个鸭场的样品为DuCV阳性,总体阳性率为47.4%;ORF-C1基因序列测定结果显示,9株DuCV之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为93.4%~100%和82.2%~100%,与NCBI中已公布的DuCV毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为77.8%~99.5%和71.5%~-99.6%;遗传进化分析显示,9株DuCV全部属于DuCV-1b亚型,其中有7株在同一分支上,与D11-JW-001等韩国毒株遗传距离较近,另外2株则与山东、广西的毒株遗传距离较近;此外,与已公布的毒株相比,9株DuCV都在158位发生了氨基酸突变,由E/D变为L/P。上述结果表明,DuCV-1仍然为我国鸭群中的优势流行基因型,但病毒的基因也在不断地发生变异,应该对其进行持续监测。
- 吕振环赵莎卢凤英杨婧韩凯凯黄欣梅赵冬敏章丽娇吴凤瑶刘宇卓李银刘青涛张小飞
- 关键词：鸭圆环病毒遗传进化分析
