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Y13F定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性被引量：2: 2016年; 为改良米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶11家族木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其Tyr^(13)(Y13)置换为Phe(F)。基于AoXyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了一种突变酶AoXyn11A^(Y13F);以重组质粒p PIC9K-Aoxyn11A为模板,采用PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Y13的密码子TAC突变为F的TTC,构建了一种突变酶基因(Aoxyn11A^(Y13F));分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A^(Y13F)在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中实施了表达,并对重组表达产物AoXyn11A和AoXyn11A^(Y13F)的耐热性进行了分析。结果表明:突变酶的最适温度T_(opt)由突变前的50℃提高到55℃;AoXyn11A^(Y13F)在50℃的半衰期t_(1/2)^(50)为95 min,较AoXyn11A(t_(1/2)^(50)=6 min)延长了约15倍。由此经Y13F定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。; 吴芹胡蝶李雪晴袁风娇李剑芳邬敏辰; 关键词：定点突变疏水相互作用

N-端置换提高木聚糖酶AoXyn11A的耐热性被引量：1: 2017年; 为提高米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶家族(GHF)11木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其N-端置换为来源于嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的同一家族耐热木聚糖酶pXYL11的对应区域。基于木聚糖酶耐热性的理性设计,采用大引物PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)的5′-端DNA片段置换为pXYL11人工合成基因(xyn11PM)的对应片段,构建出杂合木聚糖酶ATX11A基因(ATx11A)。分别将Aoxyn11A和ATx11A在毕赤酵母GS115中进行了表达,并分析了重组表达产物AoXyn11A和ATX11A的温度特性。结果表明:ATX11A的最适温度T_(opt)由AoXyn11A的50℃提升至65℃,在60℃的半衰期t_(1/2)^(60)为55 min,较AoXyn11A延长了41.3倍;ATX11A在55℃处理3 h保留60%以上的酶活性,而AoXyn11A处理15 min酶活性完全丧失。本研究通过N-端置换显著改善了AoXyn11A的温度特性。; 何瑶吴芹殷欣胡蝶邬敏辰; 关键词：木聚糖酶耐热性分子动力学模拟

木聚糖酶EvXyn11^(TS)N端区域对其耐热性贡献的生物信息学分析: 2019年; 系统分析了11家族木聚糖酶EvXyn11^(TS)N端区域对其耐热性的影响。在GenBank数据库中借助BLAST服务器搜寻与EvXyn11^(TS)序列同源性大于55%且温度特性已知的30种木聚糖酶;运用ClustalW2程序和MEGA 5.1软件对31种木聚糖酶进行了多序列比对及进化树构建,从中选择了包含EvXyn11^(TS)在内的8种代表性耐热和中温酶;采用生物学程序软件分析了所选酶在N端的异同点。分析结果表明,EvXyn11^(TS)N端的耐热有利氨基酸含量、β-折叠股A1和氨基酸相互作用等对其耐热性有一定的贡献。; 臧嘉李闯王瑞吴芹邬敏辰; 关键词：木聚糖酶耐热性

引入盐桥改善木聚糖酶AoXyn11A的温度特性被引量：1: 2016年; 为改善米曲霉(Aspergillus oryzae CICC40186)木聚糖酶Ao Xyn11A的温度特性,基于其与同一糖苷水解酶家族耐热木聚糖酶Ev Xyn11TS一级和三维结构的比对和分析,在Ao Xyn11A N端空间区域引入3对盐桥。采用大引物PCR技术对野生型木聚糖酶基因(Aoxyn11A)实施定点突变,构建突变酶Ao Xyn11AS基因(Aoxyn11AS)。分别将Aoxyn11A和Aoxyn11AS在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。酶学性质分析显示:Ao Xyn11AS的最适温度(Topt)为58℃,较Ao Xyn11A提高了8℃;突变酶在50℃的半衰期(t501/2)为60 min,较原酶延长了1倍多,其在55和60℃完全丧失酶活性的时间分别由原酶的15和4 min延长至35和15 min;而突变酶的p H特性和动力学常数较原酶改变不大。在Ao Xyn11A N端空间区域引入盐桥增加了其三维结构的刚性,从而明显改善了其温度特性。; 吴芹臧嘉李闯王瑞邬敏辰; 关键词：木聚糖酶温度特性定点突变

定点饱和突变改善米曲霉木聚糖酶的温度特性被引量：3: 2019年; 为改善米曲霉木聚糖酶AoXyn11A的温度特性,基于其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,随机替换最高B-factor值位点处的Gly21。以重组表达质粒pET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒两步PCR技术对AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Gly21的密码子实施饱和突变,将pET-28a-Aoxyn11A各突变体转化E.coli BL21(DE3),构建了突变转化子文库。以酶的热稳定性为指标,从文库中筛选出最优突变转化子(E.coli/Aoxyn11AG21I)。DNA测序结果显示,E.coli/Aoxyn11AG21I表达一种由Ile21替换了Gly21的突变酶AoXyn11AG21I。温度特性分析表明:突变酶的最适温度由突变前的55℃提高至65℃;AoXyn11AG21I在55℃及以下稳定,较AoXyn11A提高了7℃。另外,AoXyn11A突变前后的pH特性改变不大。; 吴芹臧嘉胡蝶王瑞邬敏辰; 关键词：木聚糖酶温度特性分子动力学模拟

耐热木聚糖酶基因xyn11^(EM)在大肠杆菌中的表达被引量：2: 2016年; 将人工合成经密码子优化的11家族耐热木聚糖酶基因xyn11^(EM)克隆至表达质粒p ET-28a(+)中,获得重组质粒p ET-28a-xyn11^(EM)。将其转化Escherichia coli BL21(DE3),构建表达耐热木聚糖酶的重组工程菌E.coli BL21/xyn11^(EM)。用IPTG诱导表达重组木聚糖酶Xyn11^(EM)(re Xyn11^(EM)),酶活性可达47.5 U/m L。SDS-PAGE分析显示,re Xyn11^(EM)的表观相对分子质量为24 800。re Xyn11^(EM)的最适反应温度为70℃,在70℃以下稳定。最适反应p H为6.5~7.0,在p H5.0~8.0范围内稳定。大多数金属离子和EDTA对该重组酶的活性影响不大。re Xyn11^(EM)的Km和Vmax值分别为7.2 mg/m L和54.7 U/mg。结果表明xyn11^(EM)成功在E.coli中实现了异源表达,其良好的热稳定性具有较好的工业应用潜力。; 何瑶殷欣吴芹邬敏辰; 关键词：耐热木聚糖酶大肠杆菌表达酶学性质

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吴芹