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赖氨酸脱羧酶分子改造及其催化合成戊二胺被引量：4: 2022年; 1,5-戊二胺(戊二胺)具有良好的生物活性,广泛应用在农业、医药以及工业等领域。赖氨酸脱羧酶可以催化L-赖氨酸生产戊二胺,为了提高赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺的效率,首先在大肠杆菌中克隆表达了粘质沙雷氏菌来源的赖氨酸脱羧酶(SmcadA)。生化特征表明,SmcadA最适催化pH为6.0,最适催化温度约为40℃。随后对SmcadA的第348位氨基酸进行了突变研究,筛选获得了催化效率显著提高的突变体Gly348Ala,主要原因是该突变导致蛋白中氨基酸残基和底物之间相互作用的氢键数增加,从而影响其催化效率。最后,对重组菌株细胞进行了戊二胺合成研究,催化反应25 h,含有突变体Gly348Ala的重组菌细胞可以催化合成218.2 g/L戊二胺,野生型SmcadA重组菌仅能催化合成159.2 g/L戊二胺。该研究结果为工业化酶催化合成戊二胺提供了借鉴。; OSIRE Tolbert杨套伟乔郅钠孙杨徐美娟张显邵明龙饶志明; 关键词：分子改造氢键酶催化

谷氨酸棒杆菌内源表达元件的筛选被引量：5: 2016年; 【目的】构建谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体,筛选能够启动蛋白表达的序列片段。【方法】基于谷氨酸棒杆菌表达载体p XMJ19,利用Golden Gate新型克隆方法构建表达元件插入位点,使筛选的片段能够与报告基因快速无缝衔接,同时避免残留额外的序列对表达元件效果测试产生可能存在的干扰。对本课题组前期的谷氨酸棒杆菌BZH001高、中、低溶氧条件下的发酵样品转录组数据进行分析,筛选出稳定于高转录水平的6个基因,通过软件预测每个基因的启动子区域和5′UTR区域,两者构成能够启动基因表达的功能性元件,并将其从基因组中克隆出来。以增强型绿色荧光蛋白基因egfp作为报告基因,快速测量出表达元件的效果。【结果】获得5个不同效果的内源性表达元件,最好的元件插入探测载体后在谷氨酸棒杆菌中表达的荧光强度大于3 500 RFU/OD600。【结论】通过结合转录组数据,探测载体能够快速有效筛选表达元件,为将来人们对谷氨酸棒杆菌基因工程改造和生物系统的构建提供更多基础材料。; 刘秀霞赵子豪孙杨杨艳坤白仲虎; 关键词：谷氨酸棒杆菌 RNA-SEQ 启动子

生物过程工程研究在创新生物医药开发中应用的驱动力--生物反应器被引量：6: 2016年; 近年创新生物医药在生物产业中的比重逐渐增大,也给生物产业带来了巨大的经济效益,靶点筛选及分子构建等上游技术的进步是促进生物医药进步的主要原因。随着目前细胞培养技术在生物医药生产中的广泛应用,对细胞培养技术的要求也不断提高,同时细胞培养技术的实现载体——生物反应器的技术改进和创新也越发凸显其重要性。本文介绍了生物反应器在创新生物医药产业中的应用种类、发展趋势及发展驱动力,回顾了全球范围内新型生物反应器的发展成果,包括新型反应器技术及过程分析技术在生物医药中的应用,最后,分析了中国生物反应器的发展现状与问题,指出了生物反应器的发展与进步应以提高生物培养过程的稳定性最终提高产品的质量而不是以提高产量为主要目标。本文详细阐述现代生物反应器技术及基于"质量源于设计"的质量控制理念在其中所起到的关键作用,以及生物反应器的技术发展的现状和未来走向。; 孙杨聂简琪刘秀霞杨艳坤戴晓峰白仲虎; 关键词：生物反应器生物工程微反应器

高通量培养技术在生物过程研发中的应用进展被引量：3: 2015年; 对近年来高通量培养技术在质量源于设计（Qb D）驱动下的研究进展与应用进行了阐述,重点对一些从DNA到大规模生产的放大过程中能够缩短培养时间并广泛应用于工业生产的高通量培养技术进行了详细介绍。这些技术主要包括微孔板（MTP）培养、微型生物反应器、平行发酵系统等,; 孙杨聂简琪白仲虎杨艳坤戴晓峰; 关键词：生物过程发酵系统微孔板微流控微流体微型反应器

人-鼠嵌合单链抗体的构建及其在大肠杆菌中的高效可溶性表达和发酵条件优化被引量：4: 2016年; 从人血清白蛋白HSA免疫小鼠制备的杂交瘤单克隆抗体细胞中提取总RNA,通过反转录得到c DNA,经RT-PCR的方法扩增出单克隆抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL的DNA编码序列,通过基因重组的方法将鼠源Fab段VH和VL与人源Fab段重链和轻链恒定区进行嵌合,获得人源化嵌合单链抗体(Single-chain Antibody Fragment,sc Fv),将sc Fv克隆到构建的表达载体p BY中导入到宿主菌BL21-trx B(DE3)中进行可溶性表达,在摇瓶水平通过对发酵条件进行优化,胞内可溶性表达量达到1.23 g/L,在此基础上进行反应器放大培养,对关键参数进行优化,sc Fv表达量达到2.49 g/L。通过人源化嵌合抗体的构建表达并完成了小试水平的研究,为进一步开发人源化单链抗体提供了方法和研究基础。; 刘萌孙杨杨艳坤白仲虎; 关键词：SCFV 可溶性表达酶联免疫吸附发酵条件优化

不同溶氧对谷氨酸棒杆菌代谢的影响被引量：9: 2016年; 【目的】以谷氨酸棒杆菌为研究对象,分别控制在0、30%、50%3种溶氧水平下进行发酵,分析不同溶氧水平下代谢的变化。【方法】通过检测发酵代谢物中有机酸、氨基酸的含量,以及测定代谢途径中关键酶活性及其编码基因的表达情况来考察不同溶氧水平下物质代谢发生的变化。通过检测胞内还原力和ATP的含量来分析不同溶氧水平对能量代谢产生的影响。【结果】谷氨酸棒杆菌代谢支路受溶氧的影响而发生改变,氨基酸、有机酸的产量也随之改变。特别是在低溶氧(0)情况下,细胞内氧化磷酸化减弱,导致维持生命活动所必需的ATP供应减少,因此细胞通过增强底物水平磷酸化来产生ATP以满足生命活动的需求。在此情况下,胞内NADH得到较多积累,TCA循环代谢流量减小,而转向糖酵解、乙醛酸循环等,并且这个过程伴随多种杂酸包括乳酸、缬氨酸、亮氨酸等的产生,必将影响目的产物的产量。【结论】研究结果对于进一步采取措施优化溶氧的控制策略,提高目的产物的产量具有指导意义。; 杨艳坤王芬孙杨刘秀霞白仲虎; 关键词：谷氨酸棒杆菌溶氧代谢物酶活关键基因

新型固定床生物反应器在细胞源猪伪狂犬病毒生产中的应用被引量：2: 2021年; 针对目前固定床生物反应器结构复杂、易产生泡沫等缺点,研发结构简单且可无泡通气的新型固定床生物反应器,并对该反应器的混合时间、k L a、细胞分布均匀性和细胞捕获能力进行测定。并进一步利用该反应器实施低密度接种Vero细胞进行细胞培养并扩增猪伪狂犬病毒。试验结果表明,该新型固定床反应器的混合时间、k L a与传统STR反应器相当,细胞捕获能力良好且细胞在反应器中分布均匀。采用低密度接种时Vero细胞可在该反应器中进行良好的生长,接毒5 d后累计收获的病毒总颗粒数达到10.37 log 10 TCID 50,相当于2.3×10^5剂量疫苗。该研究为细胞源疫苗的生产提供了新的反应器与技术。; 聂简琪聂简琪杨艳坤孙杨李业杨艳坤; 关键词：固定床生物反应器 VERO细胞猪伪狂犬病毒疫苗

CAR-T细胞疗法的自动化设备及展望被引量：1: 2017年; 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过从患者或者捐献者外周血分离获得T细胞,并进一步激活、基因修饰、扩增从而获得CAR-T细胞,洗涤浓缩后回输患者体内进行治疗。修饰后的T细胞肿瘤靶向性、杀伤活性更强,在血液肿瘤疾病临床试验中疗效明显,在实体瘤的临床试验中也崭露头角。CAR-T细胞疗法整个过程的安全性、无菌性、纯度等质量控制极其重要。确保CAR-T细胞疗法生产过程的标准化、封闭化与自动化,做到药效和风险可控是首要任务。对CAR-T细胞疗法工艺与自动化设备以及面临的工程化问题进行综述,以期为CAR-T细胞疗法工程化提供参考。; 聂简琪聂简琪杨艳坤孙杨刘秀霞杨艳坤白仲虎; 关键词：细胞治疗自动化设备工程化

外源蛋白表达过程中谷氨酸棒状杆菌转录组及代谢物的多变元分析被引量：2: 2017年; 以谷氨酸棒状杆菌为研究对象,在发酵罐水平30%溶解氧条件下对野生菌及表达EGFP的工程菌进行平行培养,对培养20 h的菌体进行转录组分析,并对不同时间点所取样品进行代谢物检测。利用多变元分析方法分析转录组和代谢物数据,其中主要利用主成分分析法进行关键因素分析,利用正交偏最小二乘法判别分析进行转录组数据分析,继而通过S-plot得到不同溶解氧下的生物标记物(biomarkers),最终找到了8个关键基因。代谢数据分析结果表明ATP、谷氨酸、乙酸、胞内谷氨酸、甲硫氨酸及乳酸是外源蛋白表达的关键代谢物;通过不同时间点代谢物含量变化分析发现外源蛋白表达的代谢变化类似于低氧环境下的代谢变化现象,即糖酵解增强,TCA溢流,回补途径增加,乙酸、乳酸生成增加。通过对比外源蛋白表达工程菌与野生菌的转录组数据及代谢物含量数据,为今后在代谢工程中菌株改造、优化代谢获得高效表达外源蛋白的谷氨酸棒状杆菌表达宿主奠定基础。; 孙杨刘秀霞董贵斌杨艳坤白仲虎; 关键词：谷氨酸棒状杆菌关键基因转录组测序

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孙杨

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