程静
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
- 供职机构：武汉科技大学附属天佑医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 无义突变型荧光素酶稳定表达细胞株的建立
- 2017年
- 目的:建立稳定表达含无义突变位点荧光素酶的细胞株,用以筛选新的无义突变通读剂。方法:酶切质粒p GL4-WT和p GL4-MUT,得到野生型和无义突变荧光素酶编码c DNA,分别插入到慢病毒载体p LVX-IRES-Neo多克隆位点。酶切及PCR鉴定后,将重组载体包装成慢病毒颗粒,感染HEK 293细胞,单克隆细胞抗性筛选获得稳定细胞株,提取总RNA,经逆转录PCR方法验证荧光素酶m RNA表达。最后用已知阳性无义突变通读剂G 418处理细胞,Western blot方法检测处理前后荧光素酶蛋白表达水平,同时分析荧光素酶活性。结果:经酶切获得2.7 kb长野生型和无义突变荧光素酶编码c DNA,与p LVX-IRES-Neo连接获得重组慢病毒载体p LVX-WT、p LVX-MUT,EcoRⅠ单酶切、NheⅠ与BamHⅠ双酶切结果证明序列正确插入,PCR也扩增出目的片段;稳定感染慢病毒的HEK293WT和HEK293MUT细胞经逆转录PCR方法成功检测到荧光素酶m RNA表达;阳性通读剂G 418处理细胞后发现,HEK293WT细胞在处理前后均表达荧光素酶蛋白,荧光素酶活性也基本相同,而HEK293MUT细胞在处理前不表达荧光素酶蛋白,无荧光素酶活性,处理后恢复了部分荧光素酶蛋白表达,其荧光素酶活性相当于HEK293WT细胞的20%。结论:成功建立了稳定表达无义突变荧光素酶的细胞株,可用于筛选新的无义突变通读剂。
- 谢骁祥袁辉王震宇程静吴磊杜柳涛江高峰
- 关键词：荧光素酶
