汤勃
- 作品数：9 被引量：21H指数：3
- 供职机构：兰州军区兰州总医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定
- 2007年
- 目的：建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库，并从中克隆鉴定出新的应答基因．方法：分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA，用SMARTPCR技术合成全长双链cDNA，经RsaI酶切后将感染细胞的cDNA分为两组，分别衔接两个不同的接头，再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR，将产物与T／A载体连接构建成消减cDNA文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，挑取克隆进行筛选排除假阳性，再行序列分析，鉴定胎肝细胞感染HBV后的差异应答基因．结果：成功构建高效消减的HBV感染胎肝细胞cDNA文库，得到158个白色的克隆，随机选择了128个克隆经PCR扩增获得含有明确单一目的片断的克隆99个，长约100～400bp，经筛选后得到70个克隆，测序表明有16个差异表达的基因，其中可能的新基因有5个．结论：用抑制性消减杂交技术成功建立了HBV感染培养人胎肝细胞的消减cDNA文库，为进一步大规模筛选HBV感染后的应答基因奠定了基础，初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据．
- 王方王小红王宇明汤勃张俊张静李得明
- 关键词：HBV胎肝细胞消减文库
- HBV cccDNA实时荧光定量PCR检测法的建立和初步应用
- 研究目的:HBV(hepatitis B virus)复制周期的一个重要特性是共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)池的形成和保持。多数研究证实,抗HBV治疗后肝...
- 汤勃王宇明
- 文献传递
- HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究被引量：6
- 2004年
- 目的 通过HBV体外感染 2 2周龄原代培养人胎肝细胞 ,比较常用检测指标的敏感性和特异性。方法 利用HBV阳性血清感染体外培养的原代人胎肝细胞。应用ELISA法检测培养上清中的HBsAg和HBeAg ,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg ,荧光定量PCR法检测上清和细胞中HBVDNA ,巢式PCR法检测细胞中cccDNA。结果 胎肝细胞核中的HBcAg于感染后第 2天出现阳性 ,培养上清和细胞中HBVDNA定量自第 4天起检出 ,上清中HBsAg和HBeAg于第 5～ 6天出现阳性 ;细胞中HBVcccDNA自第 8～ 9天出现阳性。结论 HBV在原代培养人 2 2周龄的胎肝细胞中能够稳定复制和表达 ,各种检测指标的灵敏性和特异性不一 ,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg敏感性好 ,特异性可。
- 王方王宇明汤勃刘俊刘国栋王小红
- 关键词：乙型肝炎病毒HBV感染人胎肝细胞细胞培养
- 改良聚合酶链反应检测HBV共价闭合环状DNA被引量：7
- 2005年
- 目的:建立一种基于聚合酶链反应(PCR)的简便快速、具有较高敏感性和特异性的检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的方法.方法:分别提取HepG2.2.15细胞内的cccDNA及培养上清中的松驰环DNA(rcDNA)样品,试剂盒纯化;设计2对特异性引物,其扩增区域跨越rcDNA单链区;设计2对非特异性引物,扩增区域位于rcDNA双链区.经单链特异性绿豆芽核酸酶(MBN)分别消化cccDNA及rcDNA样品;以特异性引物和非特异性引物对消化前后的两种样品分别进行PCR扩增,并改变PCR扩增参数如底物数量、循环次数等,观察特异性引物能否顺利扩增消化后的cccDNA,同时又不扩增消化后的rcDNA.HBV基因组质粒样品作为对照.此外还采用实际乙型肝炎患者体内病毒样本检验此策略的实用性.结果:分别以非特异性引物和特异性引物扩增不同模板数的HBVrcDNA样品,2对非特异性引物可扩增出模板数在102以上的HBVrcDNA样品,2对cccDNA特异性引物也可以扩增出模板数在104以上的样品.特异性引物在PCR反应模板数较多时将不能区分消化前的rcDNA和cccDNA.不同数量HBVcccDNA和rcDNA模板在MBN消化前后,分别应用非特异性引物和特异性引物进行PCR扩增,发现不同数量的cccDNA模板分子经过MBN消化后,仍可用特异性引物和非特异性引物扩增出相应条带;rcDNA样品经过MBN消化后,非特异性引物可扩增出产物条带,而特异性引物无法扩增出条带.采用此种策略,我们发现慢性乙肝患者血清HBV核酸样品主要成份为rcDNA,并带有少量cccDNA,而肝细胞内HBV核酸样品富含cccDNA,与实际情况一致.结论:联合应用MBN选择性消化和cccDNA特异性引物的PCR检测法简便快速,敏感性和特异性均较满意.
- 汤勃王宇明刘俊张瑞
- 关键词：共价闭合环状DNA聚合酶链反应
- 乙型肝炎病毒多聚酶末端蛋白重链可变区抗体体外抑制病毒的复制被引量：1
- 2007年
- 目的用蛋白片段互补法（PCA）选择HBV多聚酶末端蛋白（TP）重链可变区（VH）抗体，研究特异性VH抗体体外抑制HBV的复制与分泌。方法以HBV多聚酶TP区为抗原，用PCA法进行特异性VH抗体筛选。特异性VH抗体基因定向亚克隆入真核表达载体pZeoSV2（＋），构建pZeoSV2（＋）-VH重组质粒，用脂质体介导的转染技术，将其导入HepG2．2．15细胞，观察特异性抗体的生物学活性。结果用PCA法从抗体库中选择出3个特异性抗体：VH1、VH2和VH3，其中与抗原亲和力最高的是VH1。转染pZeoSV2（＋）-VH1的HepG2．2．15细胞比未转染pZeoSV2（＋）-VH1或只转染空载体pZeoSV2（＋）的HepG2．2．15细胞病毒颗粒分泌明显减少，上清液内为2．9787±0．2761比5．1504±0．2761和5．2951±0．2410（P〈0．05）；细胞内为5．2839±0．1629比8．3004±0．3232和8．5321±0．1383（P〈0．05）。结论用PCA法可从抗体库中选择出HBV多聚酶TP区特异性VH抗体，该抗体在体外可抑制HBV的复制与分泌。
- 于俊岩汤勃周吉军邓春青兰林王宇明
- 纤维结合素对HBV感染原代培养人胎肝细胞的影响被引量：1
- 2004年
- 目的 研究纤维结合素对HBV体外感染原代培养人胎肝细胞的影响。方法 用纤维结合素包被培养皿 ,利用从HBV阳性血清纯化的HBV病毒颗粒感染体外培养的人胎肝细胞。应用ELISA法检测培养上清中HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中HBcAg,荧光定量PCR法检测细胞中HBVDNA ,巢式PCR法检测细胞中cccDNA ,并和未包被的胎肝细胞进行对照。结果 未包被时上清中HBsAg和HBeAg于第 5日出现阳性 ,包被后自第 1日起出现阳性 ;未包被时胎肝细胞核中HBcAg于感染后第 2日起出现阳性 ,阳性率为 10 %～ 15 % ,包被后自第 1日起出现阳性 ,阳性率达 90 %以上 ;未包被时细胞中HBVDNA定量自第 4日起检出 ,包被后自第 1日起检出 ;未包被时细胞中HBVcccDNA自第 8日出现阳性 ,包被后自第 2日起出现阳性。结论 纤维结合素包被可以促进HBV体外感染原代培养人胎肝细胞 ,使HBV感染胎肝细胞的时间提前 。
- 王方王宇明王小红汤勃刘国栋刘俊
- 关键词：纤维结合素肝炎病毒乙型人胎肝细胞
- 孕妇及胎儿乙型肝炎病毒DNA的检测及意义被引量：7
- 2004年
- 目的定量检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA阳性孕妇及其胎儿血清、PBMCs、胎盘、胎肝组织中的HBVDNA,探讨HBV宫内传播与宫内感染的可能途径以及孕妇HBV含量与宫内传播发生的量化关系。方法用PCR荧光定量分析法筛选血清HBVDNA阳性的不同孕龄孕妇,定量检测孕妇及其流产胎儿血清、PBMCs、胎盘、胎肝组织中的HBVDNA;对阳性胎肝组织进行HBVDNA原位杂交;对阳性PBMCs检测HBVcccDNA。结果21例血清HBVDNA阳性的孕妇中,11例PBMCsHBVDNA检测阳性,其中9例HBVcccDNA检测为阴性,而胎儿PBMCsHBVDNA检测均为阴性。母血HBVDNA含量不同数量级之间胎盘、胎肝HBVDNA阳性率差异有显著性(P=0.0001,P=0.001)。HBVDNA原位杂交检测显示,2例胎肝细胞内见阳性染色,相应的胎肝组织、胎儿脐血、胎盘组织PCR检测均为HBVDNA阳性。结论HBV宫内传播经胎盘发生,孕妇PBMCs内的HBV不会发生宫内传播;母血HBVDNA含量在106拷贝/ml及以上时,胎盘感染HBV的危险性显著增加,母血HBVDNA含量在107拷贝/ml及以下时,胎肝感染HBV的危险性显著降低。
- 杨淑丽王宇明刘俊汤勃王永刚
- 关键词：宫内传播宫内感染
- 乙型肝炎病毒感染培养人胎肝细胞机制研究
- 王方张俊汤勃王宇明张小岗王小红张静李德明
- 主要技术要点：分离人胎肝细胞进行原代培养，在体外诱导胎肝细胞出现对于HBV的易感性；在上述实验的基础上，建立了双重削减策略，对比HBV易感性出现前后的胎肝细胞mRNA变化，筛选出与HBV易感性有关的基因序列；继续采用抑制...
- 关键词：
- 关键词：乙型肝炎
- 体外培养妊娠早期人胎肝细胞对乙型肝炎病毒易感性的变化被引量：2
- 2004年
- 目的 观察妊娠早期(孕10周)人胎肝细胞在不同的体外培养条件下对乙型肝炎病毒(HBV)易感性的变化,为HBV受体的发现和鉴定打下基础。 方法 设计无血清培养基,分别添加不同的细胞分化诱导物,在不同时相以HBV感染原代培养10周孕龄人胎肝细胞,检测细胞形态、功能及HBV感染标志物。 结果 培养基中添加2.5 mmol/L苯巴比妥钠,培养6d后细胞逐渐出现成熟肝细胞标志,并可被HBV感染;其他培养条件下则不能观察到HBV的成功感染。 结论 苯巴比妥钠可在体外培养时诱导早期人胎肝细胞分化,并出现HBV易感性。
- 汤勃王宇明王方刘俊张瑞
- 关键词：体外培养妊娠肝细胞HBV胎儿组织
