代忠明
- 作品数：6 被引量：10H指数：2
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 小鼠脂多糖应答蛋白LRP的大肠杆菌表达及其兔抗血清抗体的制备被引量：1
- 2006年
- 目的原核表达小鼠脂多糖应答蛋白并制备兔抗mLRP抗血清。方法参考GenBank中已登录的人lrp-cDNA序列,对小鼠的同源表达序列标签(EST)序列进行拼接,预测mlrpcDNA序列。用设计的引物,进行RT-PCR,从脂多糖刺激的NIH3T3细胞中扩增mlrp的cDNA序列,克隆入pTAT载体中,构建mlrp的原核表达载体。以其转化在大肠杆菌中诱导表达后,将获得的His-TAT-mLRP融合蛋白免疫家兔,用丙酮沉淀全菌蛋白吸附法制备纯化的抗mLRP血清,用West-ernblot鉴定抗体的特异性。结果预测的mlrpcDNA的长度为1905bp。将克隆获得的1554bp大小的mlrp-cDNA编码区序列插入pTAT质粒中,在大肠杆菌中表达出His-TAT-mL-RP融合蛋白。以其免疫家兔,制备了特异性兔抗mLRP的血清。结论mlrp的原核表达及特异性兔抗mLRP血清的制备,为进一步研究mLRP的功能奠定了基础。
- 代忠明陈苏民杜可军陈南春宋庆贺骆文静陈景元
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 人Lrp蛋白多克隆抗体的制备被引量：2
- 2007年
- 目的:制备人Lrp蛋白多克隆抗体.方法:克隆全长lrp-cDNA编码序列并进行原核表达与鉴定.用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化原核表达的全长Lrp蛋白,获得纯度较高的目的蛋白.用纯化后蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.结果:Western印迹结果表明,纯化前后的抗血清在69ku处均检测到目的蛋白条带,说明吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合.而纯化后抗体Western印迹结果目的条带只有一条,说明吸附纯化后得到高特异性抗血清,其免疫印迹的效价在10-6以上,有较高免疫印迹滴度.结论:成功制备了高效价高特异性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗体,为Lrp功能的进一步研究提供了重要的实验工具.
- 于欣平宋庆贺侯立朝杜可军熊利泽陈苏民陈南春代忠明
- 关键词：脂多糖类抗体制备
- 人lrp-cDNA全长编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达被引量：4
- 2006年
- 目的:扩增人lrp-cDNA全长编码区、并在大肠杆菌中表达和鉴定.方法:提取脂多糖刺激后HEK293细胞的总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出全长人lrp序列,将其克隆入原核表达载体pcTAT后转化大肠杆菌诱导表达,做SDS-PAGE分析;并用免疫印迹法鉴定6His-TAT-LRG融合蛋白表达.结果:测序结果表明,获得了全长人lrp-cDNA全长编码区,其序列与GenBank已经公布的不完全一致;SDS-PAGE分析表明,6His-TAT-Lrp融合蛋白在大肠杆菌中成功表达,表达量约占菌体总蛋白的17%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生阳性反应.结论:得到人lrp-cDNA全长编码区序列,并成功表达,为人lrp功能的深入研究奠定了基础.
- 宋庆贺柴玉波陈苏民陈南春黄勇代忠明
- 关键词：脂多糖应答基因逆转录聚合酶链反应
- 小鼠脂多糖应答蛋白mlrpS的载体构建及融合蛋白表达被引量：1
- 2006年
- 为构建小鼠mlrpS-cDNA基因原核、真核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白。采用反转录-聚合酶链反应从经脂多糖刺激的鼠NIH3T3细胞cDNA中,扩增出编码mlrpS的cDNA。用限制性内切酶KpnⅠandXhoⅠ消化后,插入原核表达载体pTAT中,经酶切鉴定与测序证实后,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白。经KpnⅠ和XhoⅠ酶切回收mlrpS-cDNA,插入pcDNA3.1载体中;pcDNA3.1-mlrpS再经KpnⅠ和ApaⅠ酶切后,插入到pEGFP-c1载体上,构建pEGFP-mlrpS融合的真核表达载体。构建mlrpS表达载体经测序证实,与GenBank登录的序列完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pEGFP及pTAT;SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功。说明:成功地构建了mlrpS原核、真核表达载体,成功正确表达了6His/mlrpS融合蛋白。
- 代忠明陈苏民陈南春杜可军骆文静陈景元
- 人Lrp蛋白在细胞中的定位及LPS对其表达的影响被引量：5
- 2006年
- 为了对脂多糖应答基因(lrp)的功能进行深入的研究,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化后的全长Lrp蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.Western印迹表明,吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合,并有较高免疫印迹滴度,为Lrp功能研究提供了重要的工具.激光共聚焦扫描荧光显微镜检测显示Lrp主要位于细胞核膜周围.Western印迹、RT-PCR以及细胞免疫组化染色结果都表明,用LPS刺激后,lrp在人HEK293和U937细胞内的表达均有明显的上升.结果提示,Lrp可能与对Lrp介导的反应有关.
- 宋庆贺于欣平陈苏民陈南春代忠明侯立朝
- 关键词：脂多糖抗体制备细胞内定位
- 全长人lrp基因及其截短和定点突变体真核表达载体的构建被引量：1
- 2006年
- 为了对脂多糖应答基因(lrp)的功能进行深入的研究,实验用PCR及双PCR法扩增出lrp基因的截短体(lrpΔC)和突变体(lrpm)序列,测序正确后将正常lrp基因及其截短体和突变体序列均连入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1(+)-lrp、pcDNA3.1(+)-lrpΔC和pcDNA3.1(+)-lrpm。DNA测序结果显示,PCR反应成功得到了lrp基因的截短体和突变体序列;重组质粒酶切鉴定结果显示:人lrp基因及其截短体、突变体成功连入了真核表达载体pcDNA3.1(+)。
- 宋庆贺陈苏民陈南春代忠明侯立朝于新平
- 关键词：突变真核表达载体
