张雨晴
- 作品数：6 被引量：10H指数：1
- 供职机构：北京市结核病胸部肿瘤研究所更多>>
- 发文基金：首都卫生发展科研专项国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统对MTB DNA检测方法的初步研究被引量：1
- 2020年
- 目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-1crRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为101拷贝/μl的质粒和100拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于106拷贝/μl的MTB DNA质粒的相对荧光强度�
- 于佳佳张旭霞张雨晴任卫聪姚丛李传友刘毅唐神结
- 关键词：DNA探针微阵列分析
- 结核分枝杆菌三种蛋白在结核病血清学诊断中的评价研究被引量：9
- 2017年
- 目的对结核分枝杆菌相对分子质量为38000（以下采用38kD表示）、线粒体通透性转换蛋白64（mitochondrial permeability transition64，MPT-64）和肝素结合血凝素（heparin-binding haemaggIutinin，HBHA）蛋白在外周血中抗体的表达水平进行检测和比较，并对它们在结核病血清学方面的诊断价值进行评估。方法选取2012年7月至2013年10月北京胸科医院收治的肺结核患者作为活动性肺结核（ATB）组，共78例；选取同期36例潜伏结核感染（LTBI）患者作为LTBI组；同期在北京胸科医院进行体检的31名健康人群（HC）作为HC组。将本实验室前期纯化的38kD、MPT64和HBHA作为抗原应用于免疫学的检测，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清中三种蛋白抗体的表达水平，经过统计学处理后，分别比较ATB、LTBI和HC三组之间的差异，并结合受试者工作特征曲线计算各蛋白抗原的敏感度和特异度，评价三种蛋白血清抗体的临床诊断价值。结果ELISA检测ATB组38kD蛋白抗体的吸光度（A）450cm处的A值（0．343±0．120）高于LTBI组（0．221±0．102）和HC组（0．143±0．097），差异有统计学意义（t=3．07，P〈0．05）；MPT64抗体的A450值（0．234±0．102）高于LTBI组（0．198±0．087）和HC组（0．123±0．075），差异有统计学意义（t=3．79，P〈0．05）；HBHA抗体的A450值（0．263±0．113）高于LTBI组（0．188±0．091）和HC组（0．148±0．078），差异有统计学意义（t=2．70，P〈0．05）。以38kD、MPT64和HBHA蛋白抗体表达水平从LTBI组鉴别ATB组时的受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）分别为0．78、0．61和0．62，敏感度分别为71．79％、62．82％和52．56％，特异度为72．22％、58．33％和69．44％；从HC组鉴别ATB组时的AUC分别为0．91、0．81和0．79，敏感度分别为87．17％、69．23％和73．08％，特异度为80．65％、74．19％和74．19％；从HC组
- 刘毅张旭霞张雨晴李传友
- 关键词：细菌蛋白质类酶联免疫吸附测定血清学试验
- 结核分枝杆菌三种蛋白在结核病血清学诊断中的评价研究
- 2018年
- 目的对结核分枝杆菌相对分子质量为38000（以下采用38kD表示）、线粒体通透性转换蛋白64 （ mitochondrial permeabilitytransition 64, MPT-64 ）和肝素结合血凝素（ heparin-binding haemagglutinin, HBHA ）蛋白在外周血中抗体的表达水平进行检测和比较，并对它们在结核病血清学方面的诊断价值进行评估。方法选取2012年7月至2013年10月北京胸科医院收治的肺结核患者作为活动性肺结核（ATB）组，共78例；选取同期36例潜伏结核感染（LTBI）患者作为LTBI组；同期在北京胸科医院进行体检的31名健康人群（HC）作为HC组。将本实验室前期纯化的38kD、MPT64和HBHA作为抗原应用于免疫学的检测，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清中三种蛋白抗体的表达水平，经过统计学处理后，分别比较ATB、LTBI和HC三组之间的差异，并结合受试者工作特征曲线计算各蛋白抗原的敏感度和特异度，评价三种蛋白血清抗体的临床诊断价值。结果ELISA检测ATB组38kD蛋白抗体的吸光度（A）450nm处的A值（0．343±0．120）高于LTBI组（0.221±0．102）和HC组（0．143±0．097），差异有统计学意义（t=3．07，P〈0．05）；MPT64抗体的A450值（0．234±0．102）高于LTBI组（0．198±0．087）和HC组（0．123±0．075），差异有统计学意义（t=-3．79，P〈0．05）；HBHA抗体的A450值（0．263±0．113）高于LTBI组（0．188±0．091）和HC组（0．148±0．078），差异有统计学意义（t=2．70，P〈0．05）.以38kD、MPT64和HBHA蛋白抗体表达水平从LTBI组鉴别ATB组时的受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）分别为0．78、0．61和0．62，敏感度分别为71．79％、62．82％和52．56％，特异度为72．22％、58．33％和69．44％；从HC组鉴别ATB组时的AUC分别为0．91、0．81和0．79，敏感度分别为87．17％、69．23％和7308％，特异度为80．65％、74．19％和74．19％；从HC组鉴
- 刘毅张旭霞张雨晴李传友
- 关键词：分枝杆菌结核细菌蛋白质类酶联免疫吸附测定血清学试验
- 结核分枝杆菌持留相关PcaA和Acr蛋白的表达纯化及初步应用
- 2017年
- 目的结核分枝杆菌（M．tb）潜伏感染状态是造成结核病诊断和研究的难点之一，目前的检测方法很难将潜伏感染结核病（LTBI）和活动性结核病（ATB）区分开。有文献报道分枝菌酸环丙烷合成酶（PcaA）和小分子热休克晶体蛋白（Acr）两个基因在M．tb持留状态下高表达，因此可能和菌的潜伏感染相关，有作为新的诊断靶标的可能，因此我们对它们开展了有关的研究和应用，以期为LTBI的诊断提供新的研究方向和方法。方法首先针对目的基因设计引物，从基因组上扩增其全序列，构建克隆和表达载体，纯化分离蛋白。将蛋白作为抗原应用于免疫学的检测，用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清中两种蛋白抗体的表达水平，最终经过统计学处理，分析LTBI和ATB患者之间的血清学的差异，寻找可应用于l晒床诊断分析的方法和策略。结果成功构建PcaA和Acr蛋白的克隆和表达载体，并获得表达和纯化的蛋白。血清的PcaA和Acr抗体水平检测结果显示健康对照（HC）与ATB之间差异有统计学意义，而ATB和LTBI之间差异并无统计学意义，即使将两个蛋白检测结果进行并联分析后也未显示差异有统计学意义。结论PcaA和Acr蛋白可以在大肠杆菌中成功表达并顺利纯化，PcaA蛋白有较高的抗原特异性和免疫反应性，可用于以后对结核病的检测分析中；虽然用血清学诊断时不能完整的区分LTBI和ATB，但可用于鉴别结核分枝杆菌感染与否。
- 刘毅张旭霞张雨晴姚丛李传友
- 关键词：分枝杆菌结核蛋白表达血清学
- PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统对MTB DNA检测方法的初步研究
- 2021年
- 目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMD^(TM)19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-lcrRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-lcrRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为10^(1)拷贝/μl的质粒和10^(0)拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于10^(6)拷贝/μl的MTE DNA质粒的相对�
- 于佳佳张旭霞张雨晴任卫聪姚丛李传友刘毅唐神结
- 关键词：DNA探针微阵列分析
- 结核分枝杆菌持留相关PcaA和Acr蛋白的表达纯化及初步应用
- 2017年
- 目的结核分枝杆菌（M.tb）潜伏感染状态是造成结核病诊断和研究的难点之一,目前的检测方法很难将潜伏感染结核病（LTBI）和活动性结核病（ATB）区分开.有文献报道分枝菌酸环丙烷合成酶（PcaA）和小分子热休克晶体蛋白（Acr）两个基因在M.tb持留状态下高表达,因此可能和菌的潜伏感染相关,有作为新的诊断靶标的可能,因此我们对它们开展了有关的研究和应用,以期为LTBI的诊断提供新的研究方向和方法.方法首先针对目的基因设计引物,从基因组上扩增其全序列,构建克隆和表达载体,纯化分离蛋白.将蛋白作为抗原应用于免疫学的检测,用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清中两种蛋白抗体的表达水平,最终经过统计学处理,分析LTBI和ATB患者之间的血清学的差异,寻找可应用于临床诊断分析的方法和策略.结果成功构建PcaA和Acr蛋白的克隆和表达载体,并获得表达和纯化的蛋白.血清的PcaA和Acr抗体水平检测结果显示健康对照（HC）与ATB之间差异有统计学意义,而ATB和LTBI之间差异并无统计学意义,即使将两个蛋白检测结果进行并联分析后也未显示差异有统计学意义.结论PcaA和Acr蛋白可以在大肠杆菌中成功表达并顺利纯化,PcaA蛋白有较高的抗原特异性和免疫反应性,可用于以后对结核病的检测分析中;虽然用血清学诊断时不能完整的区分LTBI和ATB,但可用于鉴别结核分枝杆菌感染与否.
- 刘毅张旭霞张雨晴姚丛李传友
- 关键词：蛋白表达血清学
