- 可用体外翻译获得的可溶天然型EGFP的表达
- 2007年
- 目的构建能在体外大量表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的pET28a-EGFP原核表达载体。方法以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,EcoR I和Hind III双酶切EGFP基因序列和pET28a载体。T4 DNA连接酶连接,转化大肠埃希菌DH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定。将pET28a-EGFP转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,观察荧光。体外翻译系统中加入重组pET28a-EGFP载体,孵育后观察荧光。免疫印迹法(Western blott)鉴定EGFP。结果测序证实pET28a-EGFP中的EGFP基因序列与GenBank中序列完全一致,荧光显微镜下观察到大肠埃希菌BL21(DE3)和体外翻译系统中强烈荧光,West-ern blot结果显示相对分子质量约为27 000的EGFP高效表达。结论成功构建了能在体内和体外稳定表达的可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步体外筛选抑菌药物提供了可靠的报告载体。
- 黄学文潘杰安仙园诸葛洪祥
- 关键词：原核表达
