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李国华: 作品数：13 被引量：23H指数：3; 供职机构：海南大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家肉羊产业技术体系建设项目更多>>; 相关领域：生物学农业科学更多>>

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牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表达被引量：2: 2015年; 本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494bp的目的片段,同时用BamHⅠ和HindⅢ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。; 赵天靖贾晓晓史巧芸郭莳雨庞峰朱华培徐开莲李亚颖彭冬梅李国华王凤阳; 关键词：L1 克隆原核表达

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达: 2017年; 为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。; 杨小健李亚颖庞峰李国华彭冬梅朱姝聂鑫曹瑞勇王凤阳杜丽; 关键词：羊传染性脓疱病毒克隆原核表达

牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达: 2015年; 基于海口市动物基因工程重点实验室获得的牛乳状瘤病毒13型(BPV-13)基因组序列信息(GenBank登录号:KM258443.2),以基因组为模板,扩增E5基因片段,将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-E5-N1,测序正确后瞬时转染HEK293细胞,应用荧光显微镜、流式细胞仪、Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果显示,E5片段大小为135bp;重组质粒pEGFP-E5-N1构建正确;荧光显微镜下观察转染重组质粒pEGFP-E5-N1的HEK293细胞,可见明亮的绿色荧光;流式细胞术分析结果显示,转染重组质粒pEGFP-E5-N1 48h后,约55.59%的细胞表达绿色荧光蛋白;Western blotting结果表明,表达的融合蛋白大小约为32ku。本试验结果为下一步研究E5基因的作用机理奠定了基础。; 庞峰史巧芸朱华培徐开莲赵天靖李亚颖彭冬梅李国华周海龙王凤阳; 关键词：E5 EGFP 真核表达

马尔他布氏杆菌KdtA基因的克隆及原核表达被引量：1: 2015年; 为了研究马尔他布氏杆菌KdtA蛋白的功能,根据GenBank中公布的马尔他布氏杆菌M5-90株KdtA基因序列,利用DNAMAN软件设计上、下游引物,以M5-90株的基因组DNA为模板,采用PCR对其进行扩增,凝胶回收纯化后得到1 341bp的目的片段;然后构建克隆重组质粒pMD20-T-KdtA,将其转化到大肠杆菌DH5α;待测序正确后,构建原核表达质粒pET-28a(+)-KdtA,再将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对基因的表达情况进行分析检测。结果表明,成功克隆了KdtA基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了KdtA基因;经诱导后得到了预期的目的蛋白,证明KdtA基因得到了成功表达。; 彭冬梅李国华李亚颖贾晓晓徐开莲朱华培赵天靖庞峰王凤阳杜丽; 关键词：克隆原核表达

羊种布鲁氏菌dhbC基因的克隆、原核表达及生物信息学分析被引量：5: 2017年; 试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C1866H2968N544O562S15,分子质量为42 496.3u,理论等电点(pI)为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性(GRAVY)为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30h,其二级结构以α-螺旋(41.94%)和无规则卷曲(31.46%)为主。; 李宝宝聂鑫杨小健曹瑞勇朱姝黄海峰张振兴彭冬梅李国华李亚颖王凤阳杜丽; 关键词：布鲁氏菌克隆原核表达生物信息学分析

羊种布鲁氏菌LpxB基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析被引量：10: 2016年; 试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到大小为1 188bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21(DE3)中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。; 聂鑫赵天靖曹瑞勇彭冬梅李国华李亚颖徐开莲朱华培庞峰王凤阳杜丽; 关键词：羊种布鲁氏菌克隆原核表达生物信息学分析

羊口疮病毒B2L和F1L基因的表达及其多克隆抗体的制备: 羊口疮又称羊传染性脓疱性皮炎,由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起,ORFV属于痘病毒科副痘病毒属,主要侵袭皮肤和黏膜。ORFV主要感染绵羊和山羊等动物,严重影响养羊业的发展,对人类健康也造成威胁。可以通过接...; 李国华; 关键词：羊口疮病毒多克隆抗体真核表达; 文献传递

羊源雷氏普罗威斯登菌的分离鉴定被引量：2: 2018年; 为了分离鉴定海南某养殖场黑山羊流鼻液、打喷嚏这一临床症状可能的致病菌,试验通过对病羊鼻拭子的无菌采集、病原菌分离培养后,利用革兰氏染色、细菌生化反应、细菌16S r RNA通用引物进行PCR反应等方法对分离得到的菌株进行鉴定。结果表明:对病羊鼻拭子培养后,得到的菌落形态一致;通过染色发现该菌为短杆状革兰氏阴性菌,进一步鉴定该菌为雷氏普罗威登斯菌。可引起海南黑山羊呼吸道疾病,为相应疾病的诊断和治疗奠基了一定的基础。; 曹瑞勇聂鑫李国华杜丽王凤阳; 关键词：海南黑山羊细菌分离鉴定生化反应

马尔他布氏杆菌LpxK基因的克隆及原核表达被引量：2: 2015年; 为了克隆马尔他布氏杆菌LpxK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中马尔他布氏杆菌M5-90株LpxK基因序列信息设计引物,从M5-90株基因组扩增出1 026bp的目的基因;然后将其连接入pMD20-T载体,转化入大肠杆菌DH5α并测序;测序正确后将目的基因连接入pET-28a(+)质粒,构建重组质粒pET-28a(+)-LpxK,并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的蛋白。结果表明,成功构建了pET-28a(+)-LpxK原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了LpxK基因,表达的融合蛋白大小约41ku且主要以包涵体形式存在。; 李国华彭冬梅李亚颖贾晓晓朱华培徐开莲赵天靖庞峰王凤阳杜丽; 关键词：克隆原核表达

马尔他布氏杆菌divK基因的克隆与原核表达被引量：1: 2016年; 为了克隆马尔他布氏杆菌M 5-90株divK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中M5-90株divK基因序列,设计了1对引物;以此菌株的基因组为模板,用设计的引物扩增出了372 bp的基因片段。用凝胶回收纯化目的基因片段,并将其与pMD 20-T载体连接,转化大肠杆菌(E.coli)DH 5α后测序;测序正确后将此基因片段克隆到pET-28a(+),构建重组质粒pET28a(+)-divK;然后,把构建好的重组质粒转化入E.coli BL 21(DE3)。1 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western-blot分析的结果表明,诱导表达的蛋白与目的蛋白的大小一致,说明本研究成功构建了pET28a(+)-divk原核表达载体,并在E.coli BL21中成功表达了divK基因。; 李亚颖冯飞庞峰李国华赵天靖彭冬梅朱华培徐开莲朱姝杨小健聂鑫曹瑞勇王凤阳杜丽; 关键词：克隆原核表达

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