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刘猛

作品数：5 被引量：18H指数：3
供职机构：河南农业大学生命科学学院更多>>
发文基金：国家自然科学基金更多>>
相关领域：生物学更多>>

合作作者

文献类型

  • 5篇中文期刊文章

领域

  • 5篇生物学

主题

  • 3篇质粒
  • 2篇重组质粒
  • 1篇引物
  • 1篇片断
  • 1篇转化率
  • 1篇连接酶
  • 1篇酶性质
  • 1篇反向PCR
  • 1篇PCR
  • 1篇PCR方法
  • 1篇PEG
  • 1篇T4
  • 1篇CB
  • 1篇DNA连接酶

机构

  • 5篇河南农业大学

作者

  • 5篇刘亮伟
  • 5篇刘猛
  • 5篇刘亚娟
  • 2篇马闪闪

传媒

  • 3篇河南科学
  • 1篇中国农学通报
  • 1篇淮阴工学院学...

年份

  • 3篇2016
  • 2篇2015
共 5 条 记 录，以下是 1-5
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排序方式：
T4 DNA连接酶性质及其平端连接功能被引量：3
2016年
T4 DNA连接酶(T4Lig)在基因工程中有重要作用,科研人员对该工具酶性质了解不全面易导致平端DNA连接效率很低、甚至失败.所以对T4Lig性质功能的全面认识有助于基因重组,特别是平端DNA连接中的应用.为了提高平端DNA连接效率,以及进一步阐明平端连接机理,本文综述了T4Lig酶分子大小、保真性、切口DNA连接机理、平端DNA连接端口检测、酶分子性质理性改造等研究进展,并对平端连接中有待解决的几个问题进行了展望.
贺添艳刘亚娟徐文选刘猛刘亮伟
关键词：T4DNA连接酶
构建重组质粒的二步PCR方法被引量：10
2015年
建立一种简单的重组质粒构建方法——二步PCR,不需要限制性内切酶对基因和载体进行酶切.第一步常规PCR中,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因,IF与基因特异性匹配,IR引物3’端与基因序列匹配、5’端含有19 bp p ET20b一端正链序列;第二步反向PCR中,以扩增的Xyn基因作为正向引物,其3’端含有19 bp与环状p ET20b模板退火、并在高保真Q5 DNA聚合酶作用下延伸,与模板另一端互补的反向引物VR协同作用,重组质粒通过PCR扩增出来.反向PCR产物经T4 DNA连接酶环化,并经Dpn I限制性内切酶消解处理,可以直接转化BL21(DE3)感受态细胞.用这种方法将622、639、1125、1209 bp大小的基因重组p ET20b中,显示出有较广泛的普适性.
韩来闯马闪闪刘亚娟刘猛刘亮伟
关键词：重组质粒PCR
长片断引物反向PCR方法构建重复序列的重组质粒被引量：3
2016年
构建重复序列的重组质粒比较困难,因为扩增重复序列会产生多聚物.利用长片断引物反向PCR方法构建重组质粒pET20b-C1-Xyn-C1,将碳水化合物结合模块C1连接在木聚糖酶Xyn两端,为类似质粒的构建提供新方法.第一步,以C1特异性正向引物LF、载体特异性反向引物VRP从pET20b-Xyn-C1模板上扩增C1-pET20b长片断DNA,作为第二步的正向引物;第二步,以pET20b-C1-Xyn为模板,Xyn特异性反向引物RX,正向引物与模板上pET20b同源区域匹配,阻止了模板上C1同源区域的匹配,从而抑制多聚物产生;反向PCR扩增得到线性重组质粒C1-pET20b-C1-Xyn,将此线性产物用T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,得到含重复序列的pET20bC1-Xyn-C1转化子.
刘猛刘亚娟徐文选贺添艳刘亮伟
关键词：反向PCR重组质粒
CBM2蛋白的高密度自诱导被引量：6
2015年
为提高外源蛋白表达量,以pET20b载体、BL21(DE3)E.coli宿主细胞,比较了乳糖和IPTG对CBM2(碳水化合物结合结构域)蛋白表达量的诱导效果。ZYM-5052自诱导培养基菌体OD600是IPTG LB培养基菌体的4.4倍。SDS-PAGE显示200μL ZYM-5052菌体细胞含有82.3μg CBM2,占细胞总蛋白55.3%;等量IPTG LB菌体细胞含有16.6μg CBM2,占细胞总蛋白25.7%。取不同培养时间等量等同OD600的ZYM-5052菌体进行SDS-PAGE,结果显示单位细胞中蛋白量随着培养时间而增加。所以高密度自诱导不仅提高了细胞生长密度、而且提高了单位细胞中蛋白表达量。自诱导方案用于表达葡聚糖酶,与IPTG LB菌体相比,自诱导菌体OD600是其2.3倍,酶活性是其4.5倍。该研究为提高外源蛋白表达量提供了较为简单、普适的高密度自诱导方案。
马闪闪韩来闯刘亚娟刘猛刘亮伟
PEG影响pET20b质粒转化率
2016年
PEG能够提高连接酶连接效率,但是对转化率的影响被忽视,特别是基因工程操作进入到精细定量阶段。以BL21(DE3)为宿主细胞,探讨32%PEG200、75℃30min处理对p ET20b质粒转化率的影响。以不经任何处理的1 ng p ET20b转化率100%作为对照,高温处理后转化率为82.3%,PEG处理后转化率为8%,PEG且高温处理后转化率为0%,利用PCR产物回收试剂盒去除PEG可恢复15.3%转化率,说明75℃高温处理对转化率影响很小,PEG则严重影响转化率,PEG且75℃高温处理导致转化失败。通过研究发现PEG严重影响转化率,提出部分恢复转化率的解决方案,并探讨了PEG影响转化率的机理。
刘亚娟刘猛徐文选贺添艳刘亮伟
关键词：PEG转化率
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