张继明
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学基础医学院分子医学与肿瘤研究中心更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金国家自然科学基金重庆市教委科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 结核分枝杆菌Zmp1基因原核表达载体的构建及表达鉴定被引量：4
- 2014年
- 目的构建结核分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(Zmp1)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增Zmp1基因;定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Zmp1;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot法鉴定。结果PCR法扩增出Zmp1基因;重组表达质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;表达的重组Zmp1融合蛋白相对分子质量(Mr)约为94 000,大小与预期融合蛋白一致;重组Zmp1融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Zmp1基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmp1融合蛋白表达。
- 张继明杨春何永林穆柳青张春燕樊宇徐蕾
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达
- 锌依赖的金属蛋白酶1促进巨噬细胞凋亡被引量：2
- 2015年
- 目的构建锌依赖的金属蛋白酶1(zmp1)基因的真核表达质粒,探讨其对巨噬细胞凋亡的影响。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增zmp1基因;克隆到真核表达质粒p EGFP-N1的多克隆位点中,构建真核表达质粒p EGFP-N1-zmp1并转染RAW264.7细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,实时定量PCR(qRT-PCR)检测zmp1 mRNA的水平;藻红蛋白标记的膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-PE/7-AAD)双染色结合流式细胞术检测Zmp1蛋白对细胞凋亡影响。结果扩增出zmp1基因;真核表达质粒经过XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切及基因测序鉴定构建成功;转染细胞24 h后,经荧光倒置显微镜观察到绿色荧光;qRT-PCR结果显示转染p EGFP-N1-zmp1的RAW264.7细胞zmp1 mRNA的表达显著升高;转染后48 h,细胞早期凋亡率有所增加。结论在RAW264.7细胞中成功表达了Zmp1并能促进巨噬细胞凋亡。
- 李鹏何永林张继明方陈城
- 关键词：卡介苗真核表达RAW264.7细胞
- 锌离子依赖金属蛋白酶1(Zmp1)抑制小鼠RAW264.7细胞增殖以及吞噬体-溶酶体的融合被引量：3
- 2016年
- 目的观察卡介苗（BCG）的锌离子依赖金属蛋白酶1（Zmp1）对RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖以及吞噬体-溶酶体融合的影响。方法在大肠杆菌BL21（DE3）中克隆表达Zmp1,用金属螯合磁珠纯化;用纯化的Zmp1处理RAW264.7细胞,采用CCK-8法检测（0、24、48、72、96）h的细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期分布;用减毒沙门菌感染RAW264.7细胞诱导吞噬体形成后,用Zmp1处理细胞,在吞噬体内的减毒沙门菌和溶酶体的溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）分别用相应Alexa Fluor（R）350抗沙门菌抗体（蓝色荧光）和Cy5抗LAMP1抗体（红色荧光）标记,通过荧光显微镜观察RAW264.7细胞内两种荧光,将其重合分析吞噬体与溶酶体融合情况。结果用Zmp1蛋白处理细胞48 h后,细胞增殖活性明显降低;处理48 h后,细胞周期中G1期细胞比例下降,S期比例增高;采用双荧光标记感染沙门菌的RAW264.7细胞,Zmp1处理后显示紫色荧光的吞噬溶酶体融合减少。结论 Zmp1抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞增殖,抑制吞噬体-溶酶体融合。
- 方陈城张继明卢楠李鹏樊宇康月茜杨春何永林
- 关键词：细胞增殖溶酶体
