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甘草水提物中miRNA对人免疫细胞基因表达的影响被引量：19: 2017年; 微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类在转录后水平调节基因表达的非编码小分子RNA,其调控基因表达、影响细胞活性的功能已为人们所重视。近年来miRNA的跨界调控成为新的研究方向,为人们更全面地认识和了解miRNA的功能提供了新的视角。植物miRNA由于通常经过了甲基化修饰,因此较为稳定,不易降解。前期研究表明,甘草干燥药材的水煎剂中存在着丰富的小分子RNA,这为了解甘草的作用机制提供了新的思路。在本研究中,利用从甘草水煎剂中提取的小分子RNA以及合成的miRNA模拟物(mimic)作用于分离自健康人的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),然后利用RT-PCR对其模式识别受体(PRR)基因以及部分转录因子、信号分子和细胞因子的基因表达变化进行了分析。结果表明甘草miRNA对人免疫细胞的基因表达具有明显的调节作用,能够显著抑制T细胞分化相关基因的表达,以及炎症和凋亡相关基因的表达。这为进一步更全面地了解甘草的作用机制以及中药新药的研制带来了新的思路。; 向静黄洁嫦徐畅何免徐鹏程张丹张文峰沈晗邵红伟; 关键词：小分子RNA 基因表达

嵌合型TCR分子的表达与组装效率分析: 2016年; 目的通过对外源TCR分子结构域的定向改造,对嵌合型TCR双链分子的表达与组装情况进行研究,探讨其对TCR基因修饰T细胞(TCR-T)内外源TCR分子与内源TCR分子错配减少的贡献,为改善TCR基因修饰的T细胞过继性免疫治疗奠定基础。方法将结构域未改造的野生型TCR分子、恒定区结构域经过改造的嵌合TCR(chim-TCR)分子及杂合TCR分子转染7402细胞,通过报告基因的表达分析TCR分子的表达情况,利用荧光共振能量转移(FRET)技术计算不同的TCR分子组合在细胞中的组装效率。结果 TCR分子经过结构域定向改造后,能够在细胞内有效地表达和组装。荧光共振能量转移(FRET)分析表明嵌合型TCR与野生型TCR分子之间形成的杂合分子FRET值明显小于嵌合型或野生型自身配对的FRET值。结论结构域定向改造的嵌合型TCRα、β链与野生型α、β双链能有效得到表达及组装,并且嵌合型TCRα、β链与野生型α、β链组装配对的效率显著降低,这为改善基因修饰的T细胞过继性免疫治疗奠定了基础。; 苏畅刘婷黄帼蓉陈楚如向静徐畅张文峰沈晗邵红伟

CRISPR-Cas9系统定向编辑TCR基因的sgRNA筛选被引量：2: 2015年; 为构建靶向T细胞抗原受体(T Cell Receptor,TCR)基因的CRISPR-Cas9基因组编辑系统,基于p X458质粒构建靶向TCR基因β链C区的CRISPR-Cas-sgRNA质粒,将其转染Hep G2细胞系,用流式细胞术检测转染效率;转染48 h后提取Hep G2细胞基因组DNA,扩增含有编辑位点的片段,测序分析该片段的峰图改变;对出现双峰的扩增片段做T-A克隆后测序分析,确定基因编辑发生的位置,并结合转染效率计算基因编辑效率.结果表明,成功构建含有3种sgRNA序列(N1、N2、S1)的p X458-sgRNA质粒,其转染效率分别为38.5%(N1)、39.7%(N2)和24.2%(S1);基因组PCR产物测序分析发现,S1组扩增片段在打靶位置出现杂峰;T-A克隆测序发现,20克隆有4个发生了基因编辑(20%),结合转染效率(24.2%)可知,编辑效率约为83%.可见,本文成功构建靶向TCR基因的CRISPR-CassgRNA质粒,并鉴定出基因编辑效率较高的一种sgRNA序列.; 邵红伟陈辉彭鑫徐畅张广献黄树林; 关键词：T细胞抗原受体靶向基因组

利用CRISPR-Cas9敲除内源性TRAC基因的研究: 目的：针对TCRαC区设计出三个CRISPR靶向编辑位点，对这三个编辑位点进行筛选，找出编辑效果较好的质粒并对其脱靶率进行评估。考察CRISPR/Cas系统对人源的不同类型的细胞系的基因编辑情况，并初步探寻人源不同类型细...; 徐畅; 关键词：TCR基因重组腺病毒基因修复; 文献传递

基于CRISPR-Cas9定向编辑TRAC基因的研究: 2017年; 目的针对人源TCRαC基因(TRAC)进行CRISPR/Cas9-gRNA的设计,并验证设计的gRNA的有效性及其脱靶率。方法利用CRISPR网站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向编辑位点筛选工具,针对TCRαC区各设计出了3个编辑位点,并据此构建CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒,将构建好的质粒转染293T细胞系,通过流式细胞术结合PCR产物的T-A克隆测序等方法验证各个gRNA序列的编辑效率。再根据所预测的潜在脱靶位点,设计相应的上下游引物进行PCR扩增后测序,检测其是否出现脱靶。结果在3组针对TCRαC区的gRNA中,site2-gRNA的编辑效率最高,并且无脱靶现象。结论针对人源TCRαC基因设计的site2-gRNA对TCRαC区具有很好的编辑效果,且无脱靶现象,为消除杂合TCR分子的产生和改善TCR修饰的T细胞(TCR-T)过继性免疫治疗奠定了基础。; 徐畅覃启富向静瞿创张丹徐鹏程张文峰沈晗邵红伟; 关键词：CRISPR

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徐畅