- 人microRNA-339慢病毒载体的构建及其对结肠癌细胞SW620迁移的影响
- 2014年
- 目的构建人microRNA-339(has-miR-339)慢病毒载体,并探讨miR-339-5p/3p对结肠癌细胞SW620迁移能力的影响。方法由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-339前体序列(pre-miR-339)及其侧翼序列,将pre-miR-339和PLVTHM载体经双酶切后连接,产生PLVTHM-pre-miR-339慢病毒载体,并经测序鉴定;以PLVTHM-pre-miR-339、psPAX2和pMD2.G三质粒包装系统共同转染293FT细胞,包装产生慢病毒。流式细胞仪筛选建立稳定过表达premiR-339的SW620细胞株,实时荧光定量RT-PCR检测miR-339-5p及miR-339-3p表达。利用细胞划痕实验进行细胞迁移能力检测。结果成功构建PLVTHM-pre-miR-339慢病毒载体,测序证实所插入基因序列完全正确。倒置荧光显微镜下观察可见转染后的293FT细胞及SW620细胞均表达绿色荧光。在过表达pre-miR-339的SW620亚细胞系中,miR-339-5p及miR-339-3p表达水平显著高于空载对照组。划痕实验结果显示:与SW620/PLVTHM-NC组相比,SW620/PLVTHM-pre-miR-339组细胞迁移减缓,划痕较宽。结论成功构建了PLVTHM-pre-miR-339慢病毒载体和稳定过表达miR-339-5p及miR-339-3p的SW620亚细胞系,并证实miR-339-5p/3p可抑制结肠癌细胞SW620的迁移能力。
- 周畅陈芳陆艳霞袁理李学农
- 关键词：结肠癌慢病毒载体细胞迁移
- PRL-1基因3’UTR荧光素酶报告基因载体及突变体的构建被引量：1
- 2014年
- 目的针对促肝细胞再生磷酸酶1(phosphatase of regenerating liver-1,PRL-1)3’端非翻译区(3-untranslatedregion,3’UTR)构建PRL-1荧光素酶报告基因载体及突变体,为研究miR-339-5p在结肠癌中调控其靶基因PRL-1提供有效的工具。方法 PCR扩增包含PRL-1的3’UTR的DNA片段,克隆至荧光素酶载体psiCHECK-2,构建psiCHECK-2/PRL-13’UTR载体;经双酶切及测序鉴定后,对psiCHECK-2/PRL-1 3’UTR重组质粒"种子区"的7个碱基进行定点突变,构建psiCHECK-2/PRL-1 3'UTR突变载体。结果克隆获得的psiCHECK-2/PRL-1 3'UTR载体中DNA片段大小及序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。"种子区"的7个碱基定点突变成功。结论成功构建了含PRL-1基因3'UTR区的荧光素酶报告基因载体及突变体,可用于后续功能研究。
- 周畅周畅陆艳霞陈芳李学农
- 关键词：定点突变
