刘丹
- 作品数：67 被引量：92H指数：5
- 供职机构：中国兽医药品监察所更多>>
- 发文基金：国家科技基础性工作专项北京市自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 鸡产蛋下降综合征病毒间接免疫荧光检测方法的建立及应用
- 2024年
- 为建立检测鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)的间接免疫荧光方法,并对该检测方法的各个步骤进行优化,以鸡产蛋下降综合征病毒多抗血清和FITC标记的兔抗鸡IgG为组合,对一抗和二抗的最适工作浓度和孵育时间进行了优化,对IFA方法进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果表明,检测接种EDSV的96孔细胞培养板时,多抗血清的最适工作浓度为1∶320,孵育时间为45 min;FITC标记的兔抗鸡IgG的最适工作浓度为1∶200,孵育时间为30 min;病毒敏感性试验表明,该方法可以检测到10-2 TCID 50/mL的病毒;多抗血清敏感度试验表明,当多抗血清稀释到1∶1280时仍可见较明显的特异性荧光;特异性试验表明,该方法只针对EDSV,而不与禽副流感病毒4型、鸡新城疫病毒等其他病原反应;批内重复性试验和批间重复性试验结果表明,该方法具有较好的重复性和可靠性。结果表明,建立的间接免疫荧光方法具有较高的灵敏度和较好的稳定性,可为我国禽源性生物材料EDSV的检测提供技术支持,有巨大的市场需求。
- 孔冬妮王嘉邓永翟天舒刘丹黄小洁薛琪候力丹吴华伟薛青红李俊平毛娅卿
- 关键词：间接免疫荧光
- 鸭肠炎病毒囊膜糖蛋白gE基因序列分析及真核表达载体的构建被引量：1
- 2014年
- 为探索鸭肠炎病毒（DEV）囊膜糖蛋白gE基因的相关特性和功能，应用PCR扩增了DEV的gE基因，全长1473bp，编码490个氨基酸，其中1～22位氨基酸为信号肽。gE基因与国内分离强毒CHv株、国内疫苗株同源性均为100％，与德国分离强毒2085株同源性达到99％，显示其高度保守。将gE基因完整开放阅读框（gE）和去信号肽的gE基因（gE’）分别克隆至真核表达载体pCDNA3．1．获得重组质粒pCDNA3．1-gE、pCDNA3．1-gE，然后应用脂质体法转染vero细胞。RT—PCR扩增证实gE、gE’均在细胞内进行了转录，而间接免疫荧光试验证实只有gE’基因在veto细胞中获得了表达，h研究gE蛋白的功能及研制鸭瘟抗体检测试剂盒奠定了基础。
- 文晶亮李启红李俊平刘丹李岭杨承槐李慧姣夏业才
- 关键词：鸭肠炎病毒真核表达
- 猪圆环病毒2型田间分离株的全基因组克隆与基因亚型分析被引量：4
- 2014年
- 为了解我国猪圆环病毒2型（ PCV2）的流行态势和毒株的基因变异情况，从北京、江苏、湖北等地疑似断奶仔猪多系统综合征（ P MWS ）患病死亡猪中采集肺脏、脾脏和淋巴结等组织，将PCR鉴定为阳性的病料在PK－15细胞上进行增殖培养，成功分离到6株猪圆环病毒2型毒株，分别命名为B07、B12、HB、LHW、LPC和NJ。对其全基因组进行克隆和序列分析的结果显示，LPC基因组全长为1766 bp，其余均为1767 bp；6个毒株序列之间同源性高达96．0％～99．9％，6个毒株与参考毒株序列的同源性为94．4％～99．8％。 PCV2全基因组的进化分析结果表明，B12、HB、LHW、LPC和NJ为PCV2b亚型，B07为PCV2d亚型，从而证实PCV2b亚型毒株成为我国猪群中分离率较高的流行毒株，并且我国猪群存在PCV2d亚型毒株。
- 郎洪武刘丹陈晓春方超高金源吴华伟邓永陈建
- 关键词：猪圆环病毒2型全基因组
- 运用实时荧光定量PCR法检测感染鸡种蛋中的REV被引量：1
- 2017年
- 为研究通过种蛋检测的方法监测SPF鸡群REV感染情况,运用已建立的荧光定量PCR方法检测攻毒母鸡种蛋中REV,并与血清REV水平进行比较。人工感染12月龄母鸡,从种蛋中提取蛋清,接种正常鸡胚成纤维细胞后传代一次,之后石蜡密封孵化至9日龄制成鸡胚成纤维细胞(CEF),运用荧光定量PCR方法检测蛋清,并和血清的检测结果进行比较,结果显示:83份蛋清,3份阳性样品分别收集自攻毒后的第8、11、14天;46份CEF,2份阳性样品分别收集自攻毒后的第11天和第14天,阳性的蛋清和CEF呈对应关系,说明两种方法的检测结果一致。攻毒后的6~15 d是病毒血症持续期,阳性鸡蛋均采集自这段时间,表明通过种蛋REV检测能反映SPF鸡的急性感染状态。本研究为通过种蛋抗原检测从而监测SPF鸡REV感染奠定基础。
- 黄小洁杨承槐刘丹侯力丹李慧姣李俊平陈晓春
- 关键词：网状内皮组织增生症病毒蛋清鸡胚成纤维细胞
- 不同处理方式对外源病毒检测中FAdV-I检出限量的影响
- 2022年
- 据报道Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-I)在禽活疫苗中的污染是其可能的传播途径之一,加强对活疫苗中FAdV-I检测至关重要。为探索建立FAdV-I检测标准,本研究参照《中华人民共和国兽药典》中外源病毒检测相关疫苗处理措施,对不同方式处理后FAdV-I检测的影响进行了摸索。结果显示:当离心力不大于8000×g时,4℃离心10 min不会引起FAdV-I病毒含量下降,10000×g和12000×g分别离心10 min,病毒含量分别下降50%和68%,8000×g离心后再经0.45、0.22μm滤膜各滤过一次,病毒含量下降68%;8000×g离心后0.45、0.22、0.1μm滤膜各滤过1次后,病毒含量下降90%,12000×g离心后0.45、0.22、0.1μm滤膜各滤过1次后,病毒含量下降95%;SPF鸡血清及检验中常用的抗血清中和疫苗过程中在4℃或37℃作用1 h均不会引起FAdV-I病毒含量降低。上述指标为疫苗中FAdV-I污染的检测方法建立提供了参考数据。
- 侯力丹刘丹刘丹薛麒翟天舒李俊平李俊平陈晓春
- 关键词：活疫苗外源病毒
- 传染性法氏囊病病毒BC6/85株全基因组克隆及其序列分析
- 以传染性法氏囊病病毒(IBDV)BC6／85株基因组RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增并克隆了IBDV BC6／85株基因组全长cDNA。序列测定结果表明：A节段全长共3260个核苷酸，与IM株的同源性最高为97.4...
- 于雷杨承槐李俊平李启红刘丹黄建华李慧姣
- 关键词：传染性法氏囊病病毒基因克隆
- 外源性马立克氏病病毒荧光定量PCR检测方法的建立
- 2023年
- 【目的】为解决现有兽用生物制品外源性马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)检验方法灵敏度低、检测时间长、鉴别性不强的问题,研究分别建立MDV血清1型(MDV serotype 1,MDV 1)和MDV血清3型(MDV serotype 3,MDV 3)毒株的实时荧光定量PCR检测方法,用于禽用生物制品纯净性控制。【方法】从NCBI下载MDV 1、MDV血清2型(MDV serotype 1,MDV 2)和MDV 3各毒株UL19序列,进行核苷酸和氨基酸序列比对分析;分别针对MDV 1 CVI988毒株、MDV 3 FC126毒株的UL19设计特异性引物和相应的Taqman探针,建立实时荧光定量PCR检测方法;分别构建相应的重组质粒作为阳性标准品,建立标准曲线,并评价所建立方法基因拷贝数检测的灵敏度;分别对其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料(SPF鸡胚尿囊液、胚体、尿囊膜、鸡胚成纤维细胞)进行检测,评价检测方法的特异性;分别对600、60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006 PFU的CVI988毒株和FC126毒株进行检测,评价所建立方法检测活病毒粒子的灵敏度;分别以不同稀释度的阳性标准品质粒为模板,进行3次重复性检测,计算变异系数,分析所建立检测方法的可重复性。【结果】MDV UL19在同一血清型内核苷酸和推导的氨基酸同源性达99.99%,具有很高的保守性,在不同血清型间核苷酸同源性只有约75%,推导的氨基酸同源性只有约85%;分别建立了MDV 1和MDV 3两种实时荧光定量PCR检测方法;MDV 1检测方法标准曲线的扩增效率E=98.8%,相关系数R^(2)=0.992,标准曲线方程Y=-3.351X+38.828(Y=Ct,X=lg(拷贝数)),MDV 3检测方法标准曲线的扩增效率E=95.0%,相关系数R^(2)=0.998,标准曲线方程Y=-3.447X+36.496(Y=Ct,X=lg(拷贝数));所建立的两种检测方法特异性好,MDV 1或MDV 3毒株扩增曲线良好,其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料未出现特异性扩增曲线;灵敏度高,M
- 苏佳赵炜刘丹王嘉白洪旭吴华伟薛青红陈晓春
- 关键词：马立克氏病病毒实时荧光定量PCR外源病毒
- 副流感病毒5型SH蛋白单克隆抗体的制备
- 2021年
- 为获得副流感病毒5型SH蛋白的单克隆抗体,将构建的重组表达质粒pET43a-SH转化BL21(DE3)plys,经IPTG诱导表达、过镍柱纯化后将重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄Balb/c雌性小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光方法进行筛选,获得3株杂交瘤细胞株,命名为5B9、3G8、4E11,并进行了培养特性、分泌抗体活性、分泌抗体亚类的鉴定。结果显示:3株细胞株连续传代10代均稳定分泌单克隆抗体,细胞上清液IFA效价稳定,分泌单克隆抗体亚型均为IgG2a。制备并纯化了1株(5B9)单克隆抗体,浓度为4.26 mg/mL,纯度不低于90%,IFA效价不低于1∶2000,与猪牛等常见病毒均无交叉反应。
- 吴华伟刘丹陈晓春高金源邓永秦义娴苏佳黄小洁薛青红陈延飞
- 关键词：单克隆抗体
- 猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用被引量：17
- 2014年
- 猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒同属于黄病毒科瘟病毒属,在基因组序列上有很高的同源性,2种病毒交叉污染的情况十分严重,给疫病诊断和疫苗质量控制带来很大麻烦。为了更好的对这2种病的病原进行分子生物学鉴别检测,参考GenBank上2种病毒标准株的基因组序列,选取各自的保守基因区域设计可以进行鉴别检测的特异性引物,经过对PCR反应条件的优化,建立了可以对2种病毒同时检测的双重RT-PCR方法。该方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型的扩增结果均为阴性;该检测方法的敏感性为5ng病毒基因组RNA。建立的猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可以用于2种疫病的临床分子检测,也可用于猪瘟疫苗的质量控制,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。
- 李晶梅刘丹薛霜秦红刚陈其兵靖志强漆世华谢红玲
- 关键词：猪瘟病毒牛病毒性腹泻病毒
- 鸡传染性支气管炎病毒H120株和H52株种毒的制备与鉴定
- 2019年
- 鸡传染性支气管炎病毒H120株、H52株种毒由中国兽医药品监察所制备和供应,种毒的保存期为10年,为了保证种毒的质量和供应,需要定期制备种毒。将H120株、H52株毒种接种SPF鸡胚进行传代培养,收获鸡胚尿囊液,与50 g/L牛乳蔗糖溶液等体积混匀,进行分装和冷冻真空干燥。对其进行剩余水分测定、真空度测定、病毒含量、安全性、免疫原性、纯净(无菌检验、支原体检验、外源病毒)和特异性检验,检验结果表明,各项检验均符合规定。同时为了区分H120株、H52株种毒,用实验室已建立的RT-PCR和酶切方法对两种种毒进行鉴别检验,结果表明能准确区分H120株和H52株种毒。试验结果为疫苗生产提供了能长期保存且稳定性好、高滴度的生产用种毒,也可为其他禽源病毒种毒的制备提供借鉴。
- 孔冬妮侯力丹刘丹李启红杨承槐黄小洁
- 关键词：鸡传染性支气管炎病毒种毒
