贺志良
- 作品数：5 被引量：10H指数：2
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- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 人轮状病毒vp4全基因原核穿梭表达质粒的构建及鉴定被引量：8
- 2011年
- 目的构建人轮状病毒(Rotavirus,RV)vp4全基因原核穿梭表达质粒,经大肠杆菌表达验证后转化入双歧杆菌。方法从pMD19-T simple-vp4质粒中扩增RV vp4全基因,克隆至pBEX载体中,构建重组表达质粒pBEX-vp4,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,电转化法将重组质粒转化入双歧杆菌,提取质粒,进行PCR及双酶切鉴定。结果重组表达质粒pBEX-vp4经酶切、PCR和测序证明构建正确;在大肠杆菌BL21(DE3)中可表达相对分子质量约87 000的重组VP4蛋白,表达量较低,以包涵体形式表达,可与羊抗人轮状病毒多克隆抗体特异性结合;经PCR及双酶切鉴定,重组质粒pBEX-vp4已成功转入双歧杆菌中。结论重组表达质粒pBEX-vp4可在大肠杆菌中表达RV VP4蛋白,并可经电转化法有效地将重组表达质粒转化入双歧杆菌,为下一步在双歧杆菌中进行表达及研制基于双歧杆菌表达系统的RV重组亚单位口服活疫苗奠定了基础。
- 李世彬李江贺志良姜柯安张璐渝刘革力马永平
- 关键词：轮状病毒疫苗VP4双歧杆菌
- 产肠毒素大肠杆菌987P菌毛蛋白FasA亚单位的原核表达及其免疫原性被引量：1
- 2012年
- 目的表达、纯化产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)987P菌毛蛋白FasA亚单位,并检测其免疫原性。方法将去掉5′端信号肽序列的fasA基因克隆至原核表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-fasA,转化E.coli M15,0.5 mmol/L IPTG诱导表达。表达的融合蛋白6×His-FasA经Ni-Agarose His纯化和复性后,经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,每次100μg,共免疫3次,间隔2周,末次免疫10 d后,摘除小鼠眼球取血,分离血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果重组表达质粒pQE-30-fasA经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的6×His-FasA融合蛋白相对分子质量约为18 500,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%;纯化的蛋白纯度可达95%,浓度为0.6 mg/ml,免疫小鼠所得抗血清效价为1∶125 000。结论已成功在E.coli M15中表达了6×His-FasA融合蛋白,纯化的融合蛋白免疫原性良好,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。
- 贺志良姜柯安宋方洲马永平
- 关键词：原核细胞基因表达免疫原性
- 重叠延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表达被引量：2
- 2011年
- 目的用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(ltb)的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达。方法设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC(44815)质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coliB1221(DE3)进行表达,SDS-PAGE及W estern blotting分析其表达。电转法将重组质粒转入双歧杆菌。结果合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。
- 李江马永平李世彬贺志良姜柯安
- 关键词：重叠延伸PCR
- 产肠毒素大肠杆菌987P菌毛FasA亚单位的原核表达、纯化及免疫原性分析
- 产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia Coli，ETEC)是引发仔猪、牛犊、羔羊等农场家畜(禽)水样腹泻的最主要致病菌之一，其高发病率和致死率给畜牧养殖业造成很大经济损失[1]。ETE...
- 贺志良
- 关键词：产肠毒素大肠杆菌粘附素原核表达免疫原性
- 文献传递
- 产肠毒素大肠埃希菌CfaB亚单位的免疫原性分析
- 2012年
- 目的表达并纯化产肠毒素大肠埃希菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)CFA/I定居因子的CfaB亚单位,分析其免疫原性。方法将不含信号肽序列的cfaB基因克隆到pQE-30上,构建重组质粒pQE-30-cfaB并转化E.coli M15,表达融合蛋白6×His-CfaB,将表达的蛋白纯化和复性后免疫BALB/c小鼠,制备抗CfaB的抗血清,用ELISA法检测抗血清效价。结果 6×His-CfaB融合蛋白高效表达,相对分子质量为15.5 kD,纯化复性后免疫小鼠所得抗血清效价为1∶125000。结论成功构建了高效表达6×His-CfaB融合蛋白的重组质粒,表达的融合蛋白免疫小鼠后获得了高效价的抗血清,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。
- 贺志良姜柯安宋方洲马永平
- 关键词：原核表达抗血清免疫原性
