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靶向Mcl-1的shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响被引量：2: 2009年; 目的设计以髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建携带此shRNA的重组质粒,探讨脂质体转染该重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。方法设计3对针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体psi RNA-hH1neo-Mcl,用阳离子脂质体法将重组质粒转染至人肝癌细胞株HepG2中,通过RT-PCR及Western blot方法检测转染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达情况,筛选能高效抑制Mcl-1基因表达的shRNA重组质粒并应用MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖和凋亡变化的情况。结果成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pMclsi-1、pMclsi-2、pMclsi-3。经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染HepG2细胞后,Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以pMclsi-1重组质粒下调效应最强。MTT检测显示pMclsi-1可明显抑制HepG2细胞增殖,流式细胞仪测定转染后24 h细胞凋亡率为6.5%,48 h细胞凋亡率为15.6%,显著高于对照组(3.9%,P<0.05)。结论采用RNAi技术可特异阻断Mcl-1基因的表达,Mcl-1基因有促进细胞增生及抑制凋亡的作用。; 余琴陈琼黄焕军宋宇虎常莹田德安林菊生; 关键词：短发夹状RNA 细胞增殖

人XAF1基因启动子的克隆及其在人肝癌细胞株中活性的测定被引量：1: 2009年; 目的分析XAF1基因启动子在肝癌细胞株中的活性,为研究XAF1基因转录调控的基本机制奠定基础。方法从肝癌细胞株中扩增XAF1基因的1 395 bp启动区域片段并分别克隆到报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1中,分别将含有XAF1基因启动子的报告基因载体pGL3-basic和pEGFP-1转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721,检测萤火虫荧光素酶的活性并观察绿色荧光蛋白的表达。通过转染细胞、荧光素酶活性测定及观察绿色荧光蛋白的表达,检测其启动子活性。结果重组的质粒经双酶切和测序结果证实克隆的XAF1启动子片段序列正确;转染后的HepG2、SMMC7721荧光素酶相对发光强度分别是6.97±0.74、6.12±0.59。其绿色荧光蛋白强度明显低于对照组。结论本实验构建的含XAF1启动子的报告基因质粒为研究XAF1基因的转录调控提供实验依据。; 陈琼余琴汪志军里进胡晓文王晶常莹林菊生; 关键词：基因 XAF1 启动区转录调控

针对Mcl-1的shRNA重组质粒体外增强肝癌细胞对化疗敏感性的实验研究被引量：1: 2015年; 目的构建针对髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)的shRNA的重组质粒,探讨该重组质粒对肝癌细胞化疗敏感性的影响。方法设计3对针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体psiRNA-hH1neo-Mcl,用阳离子脂质体法将重组质粒转染至人肝癌细胞株HepG2中,采用RT-PCR和Western blot方法检测转染后Mcl-1mRNA及蛋白表达情况,筛选Mcl-1基因表达沉默效应最好的重组质粒。用MTT和流式细胞仪分别检测单独使用丝裂霉素(Mitomycin,MMC)、单独使用重组质粒以及联合使用重组质粒与MMC对HepG2细胞的增殖和凋亡的影响。结果成功构建含不同shRNA片段的重组质粒,依次命名为pMclsi-1、pMclsi-2、pMclsi-3。经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染HepG2细胞后,Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以pMclsi-1下调效应最强。MTT检测显示,pMclsi-1联合化疗药物MMC对HepG2细胞增殖的抑制活性显著高于单用MMC组或单用pMclsi-1组,流式细胞仪检测显示,pMclsi-1联合化疗药物MMC促进HepG2细胞凋亡的活性显著高于单用MMC组或pMclsi-1组。结论针对Mcl-1基因的siRNA可特异阻断Mcl-1基因的表达,从而明显增强肝癌细胞对化疗药物MMC的敏感性。; 余琴刘曌宇陈琼常莹林菊生; 关键词：MCL-1 SHRNA 丝裂霉素肝癌细胞化疗敏感性

I-Sce I系统的建立及其在诱导肝癌细胞DNA双链断裂中的应用: 2008年; 目的建立I—Sce I系统并应用该系统制备DNA双链断裂（DSB）的HepG2细胞模型，为进一步研究DSB与HBVDNA整合奠定基础。方法通过分子克隆技术构建携带I—Sce I内切酶识别序列的pEGFP。真核表达载体，并将其转染入肝癌细胞株HepG2，经G418筛选出稳定转染株，随后瞬时转染表达归位内切酶I—Sce I的质粒pCMV-3NSL-I-Sce I。24h后采用免疫荧光法和Western blot检测DNA双链损伤效应分子Y—H2AX的表达，了解DSB情况。结果酶切鉴定和测序证实pEGFP。构建成功；I-Sce I系统引入后HepG2细胞中的γ-H2AX表达明显上调，提示DSB细胞模型构建成功。结论I-Sce I系统能够成功地诱导HepG2细胞株基因组发生DSB，该系统有望为进一步探讨DSB是否为HBV整合的潜在靶位提供有效的研究工具。; 任精华何文山林菊生张强何星星陈琼刘瑶徐冬

肝细胞癌组织XAF1表达及其临床意义的研究被引量：2: 2008年; 目的:探讨XAF1在原发性肝细胞癌发生中的作用。方法:应用RT-PCR技术检测人胎肝细胞株LO2、人肝癌细胞株SMMC7721、HepG2和30例肝癌及其相应癌旁组织XAF1mRNA的水平,同时应用免疫组织化学方法及蛋白质印迹检测上述细胞株及组织中XAF1蛋白的表达。结果:人胎肝细胞株LO2检测到XAF1mR-NA和蛋白的表达,人肝癌细胞株SMMC7721、HepG2XAF1mRNA和蛋白的表达低。肝癌组织XAF1mRNA和蛋白表达较癌旁组织显著降低(mRNA:0.587±0.064,1.013±0.159,t=2.392,P=0.000;蛋白:43179±11412,95541±30153,t=3.532,P=0.000)。免疫组化染色显示,XAF1蛋白表达集中在肝细胞胞质和胞核中,表达下调的XAF1蛋白与原发性肝细胞癌患者病理分期有显著相关性。结论:XAF1mRNA及蛋白在肝癌组织及肝癌细胞系中表达水平降低,提示可能是促进肝细胞癌发生的一个重要因素。; 陈琼林菊生任精华徐东; 关键词：肝细胞凋亡

肾母细胞瘤过度表达基因对大鼠肝星状细胞生物学行为的影响被引量：1: 2007年; 目的:构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)的小干扰RNA(siRNA)的重组质粒,研究NOV对大鼠肝星状细胞(HSC)活化、增殖、凋亡、分泌细胞外基质(ECM)的影响方法:以NOV为目的基因,以质粒psiRNA- hHlneo为载体,构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA (psiRNA1,2,3)和阴性对照重组质粒pconsiRNA.限制性酶切和测序鉴定构建成功后,脂质体介导重组质粒转染HSC,依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组,并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组.半定量RT-PCR检测HSC的NOV、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达情况,Western blot检测α-SMA蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞凋亡.结果:限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOVsiRNA表达质粒:与阴性对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV、α-SMA的mRNA表达水平下降(73.0% vs 23.2%,51.4% vs 15.1%,均P<0.05),Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达水平明显下降(59.8% vs 17.0%,37.1% vs 6.6%,P<0.05),α-SMA蛋白表达水平下降.与空白对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内HSC增殖活性显著降低(24 h:0.172±0.005 vs 0.318±0.018.P<0.05:48 h:0.296±0.004 vs 0.472±0.029,P<0.05:72 h:0.432±0.024 vs 0.672±0.050,P<0.05).psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV mRNA、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达及HSC增殖活性均无明显下降(均P>0.05).结论:NOV可促进HSC增殖、活化及分泌细胞外基质,提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点.; 徐冬林菊生任精华陈琼姚津剑何星星; 关键词：小干扰RNA 肝星状细胞

5-Aza-CdR对人肝癌细胞株SMMC7721生长及XAF1基因启动子异常甲基化的影响被引量：2: 2009年; 目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株SMMC7721生长的影响以及对具有促凋亡作用的X染色体连锁凋亡抑制因子相关因子1(XAF1)的基因表达和甲基化的影响。方法用不同浓度的5-Aza-CdR处理SMMC7721细胞后,RT-PCR法检测XAF1 mRNA的变化,MSP检测XAF1基因甲基化的变化,用MTT法检测5-Aza-CdR对SMMC7721细胞增殖活性的影响,流式细胞仪检测其对SMMC7721细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率的影响。结果经过5、10μmol/L 5-Aza-CdR处理后,RT-PCR检测显示,SMMC7721中XAF1mRNA表达比对照组增加,差异有统计学意义(分别是P=0.034,P=0.002)。MSP检测结果XAF1的甲基化得到了逆转。用1、5、10μmol/L的5-Aza-CdR处理SMMC7721细胞24、48、72 h后,MTT检测到细胞的生长受到抑制,且呈时间和剂量依赖性。流式细胞仪分析表明,各药物浓度处理72 h后凋亡率均明显增加,5、10μmol/L组细胞凋亡率分别为(7.23±0.92)%、(12.62±1.30)%,与对照组(3.53±0.40)%相比差异有统计学意义(分别是P=0.013,P=0.001)。其细胞周期阻滞于S期。结论5-Aza-CdR抑制SMMC7721细胞的生长,使XAF1基因异常甲基化状态得到逆转,XAF1基因转录水平上调,为其应用于肝癌治疗提供了实验依据。; 陈琼林菊生常莹余琴里进胡晓文王晶; 关键词：甲基化

γ-H2AX分析用于检测电离辐射致HepG2细胞DNA双链断裂的研究被引量：4: 2007年; 目的应用γ-H2AX分析检测电离辐射导致肝癌细胞株HepG2基因组DNA双链断裂的情况，并检测在不同细胞周期时相中的表达差异，从而了解不同时相HepG2细胞株的辐射敏感性。方法利用胸腺嘧啶核苷（TdR）阻断HepG2细胞于G1期末，于不同时间点分别得到同步化的S期和G2/M期细胞，用60Coγ射线照射细胞，建立DNA双链断裂模型，采用免疫荧光法和Westemblotting检测γ-H2AX的表达。结果TdR阻断后继续培养至34和40h，分别得到了较高同步化程度的S期和G2／M期HepG2细胞；受照后的HepG2细胞中Y-H2AX表达较照射前显著增高，处于S期的细胞γ-H2AX表达增加更为突出。结论不同周期时相的HepG2细胞受照后均检测出不同程度的DNA双链断裂，其中S期细胞尤为敏感。γ-H2AX对DNA双链断裂快速敏感的反应使γ-H2AX分析在检测早期DNA双链损伤中具有广泛的廊用前景。; 任精华林菊生刘瑶陈琼董旭昇; 关键词：Γ-H2AX DNA双链断裂电离辐射

肾母细胞瘤过度表达基因对大鼠肝星状细胞MMP-1和TIMP-1表达的作用研究: 2008年; 目的构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)的小干扰RNA(siRNA)的重组质粒,研究NOV对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响。方法以NOV为目的基因,以质粒psiRNA-hH1neo为载体,构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA(psiRNA1、2、3)和阴性对照重组质粒pconsiRNA。限制性酶切和测序鉴定构建成功后,脂质体介导重组质粒转染HSC,依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组,并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组。半定量RT-PCR检测HSC的NOV、MMP-1、TIMP-1 mRNA表达情况,MTT法检测细胞增殖。结果限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOV siRNA表达质粒;与阴性对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV的mRNA表达水平下降(P<0.05),MMP-1 mRNA表达水平下降不明显(P>0.05),而TIMP-1 mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。与空白对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC增殖活性显著降低(P<0.05)。psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV、MMP-1和TIMP-1 mRNA的表达及HSC增殖活性均无明显下降(P均>0.05)。结论NOV可促进HSC增殖及表达TIMP-1增加,而对MMP-1表达影响不大,提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点。; 徐冬任精华陈琼姚津剑; 关键词：金属蛋白酶组织抑制因子小干扰RNA 肝星状细胞

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陈琼

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