刘剑
- 作品数：4 被引量：1H指数：1
- 供职机构：广东药学院生命科学与生物制药学院更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目更多>>
- 相关领域：医药卫生文化科学更多>>
- 一种天门冬氨酸蛋白酶活性部位基序中酸性氨基酸的作用被引量：1
- 2009年
- 背景:组织蛋白酶E是一种细胞内天门冬氨酸蛋白酶,属于胃蛋白酶家族,它由两个同源结构域组成,每个结构域含有一个保守基序DTG,其中第98位天门冬氨酸残基的作用尚属未知。目的:检验第98位天门冬氨酸残基的重要性。设计、时间及地点:观察实验,于2007-11/2008-12在广东药学院完成。材料:参照文献方法制备大鼠组织蛋白酶E抗体,并通过亲色谱法纯化。PcDNA3.0由广州英韦创津生物科技有限公司提供。人胚肾293细胞株由中科院上海细胞库提供。方法:在SmaⅠ和XhoⅠ间将含有全长大鼠组织蛋白酶E的cDNA插入pBluescriptIISK-质粒中。通过Kunkel基因定点突变方法,将大鼠组织蛋白酶E内第98位天门冬氨酸残基用另一种酸性氨基酸,谷氨酸替代,构建成变异体D98E,并在人胚胎肾细胞中进行表达。主要观察指标:观察野生型和变异体蛋白的表达,将野生型和变异体组织蛋白酶E蛋白纯化,对变异体组织蛋白酶E的酶活性、折叠及自我加工等进行分析。结果:当将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在人胚胎肾293细胞中进行异源表达时,在细胞培养基和细胞提取物中都发现有野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E的酶原蛋白表达。突变体D98E仍具有自我转化为成熟型酶的能力,尽管它们的酶活性只是野生型的13%。变异体的Km值与野生型的相似,但它的Kcat值却比野生型显著下降。变异体和野生型酶都被胃酶抑素和蛔虫胃蛋白酶抑制剂所抑制,Ki值几乎相同。变异体在各种酸碱度下的圆二色光谱与野生型基本相同。结论:第98位苏氨酸残基对酶的催化活性确实非常重要,其可被谷氨酸部分替代,其变异体D98E酶催化活性下降。原因与变异导致变异体水解底物的效率下降有关。
- 刘剑
- 药学院生物专业免疫学教学改革的探索和实践
- 2014年
- 通过对药学院生物专业免疫学实验教学改革的探索，与生物技术专业紧密相连，调整教学内容，适应专业发展；加强讨论式、启发式教学，实验教学与科研相结合，提高学生科研思维和实践能力；多种教学手段联合应用，提高免疫学的教学质量和教学效果。
- 张帆孙艳王辉吴凤麟刘剑
- 关键词：免疫学教学改革教学与科研结合
- 组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基对酶活性的作用
- 2009年
- 目的探讨组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基在酶活性中的作用。方法通过基因点突变，将大鼠组织蛋白酶E内羧基端的活性部位基序中第284位苏氨酸残基用丝氨酸进行替代，构建变异体T284S。结果当将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在HEK293T细胞中进行异源表达时，在细胞培养基和细胞提取物中都发现有野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E的酶原蛋白表达。突变体T284S仍具有自我转化为成熟型酶的能力，尽管它们的酶活性只是野生型的40％，变异体的Km值与野生型的相似，但它的Keat值却比野生型显著下降。变异体和野生型酶都被胃酶抑素和蛔虫胃蛋白酶抑制剂所抑制，Ki值几乎相同。变异体在各种酸碱度下的圆二色光谱与野生型基本相同。结论（1）第284位苏氨酸残基对酶的催化活性确实非常重要。变异体T284S酶催化活性的下降是由于多出来的甲基使活性部位氢键的分布发生改变，从而使酶与底物的作用模式发生改变。（2）BACE-1不能被胃酶抑素抑制，可能与羧基端结构域的活性部位基序差异无关，而与BACE1蛋白结构中的其它部分有关。
- 刘剑
- 组织蛋白酶E氨基端催化性残基的确定
- 2009年
- 目的验证组织蛋白酶E保守基序DTG中第98位天门冬氨酸残基为组织蛋白酶E氨基端催化性残基。方法通过基因定点突变技术将第98位天门冬氨酸残基用丙氨酸替代,制成变异体D98A,并将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在人胚胎肾293T细胞中进行异源表达。结果在细胞培养基和细胞提取物中都发现有野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E的酶原蛋白表达。突变体D98A酶原在酸性条件下不能转变为酶,也没有酶活性。结论组织蛋白酶E第98位天门冬氨酸残基是酶的催化性残基,对酶的催化活性非常重要。
- 刘剑
