周泽军
- 作品数：10 被引量：40H指数：5
- 供职机构：广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金国家科技支撑计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统注射装置蛋白VscO的原核表达及免疫原性被引量：7
- 2014年
- 为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(NO.KJ179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。
- 庞欢瑛周泽军丁燏黄郁葱吴灶和简纪常
- 关键词：溶藻弧菌原核表达免疫原性
- 溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白HutB的原核表达及纯化被引量：6
- 2014年
- 为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901血红素结合蛋白HutB作为疫苗候选抗原的可能性,采用PCR方法扩增V.alginolyticus HY9901 hutB基因全长序列,克隆到pMD18-T载体,经双酶切、连接后,定向插入到pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-HutB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE验证后,优化诱导表达条件和纯化条件,并进行Western-blot分析。结果表明,HutB蛋白在E.coli中诱导表达的最优条件:0.4 mmol/L IPTG,37℃诱导4h,表达的蛋白分子量与预期大小相符,主要以包涵体的形式存在,300 mmol/L咪唑洗脱时效果最佳,能与鼠抗His-tag单抗特异性结合。
- 薛丽丽庞欢瑛黄郁葱吴灶和简纪常周泽军
- 关键词：原核表达纯化
- 溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白VscO的基因克隆及其生物信息学分析被引量：9
- 2014年
- 克隆了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(T3SS)分子伴侣护航蛋白(Chaperone escort protein)vscO基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,vscO基因全长462 bp,编码153个氨基酸,理论分子量约为18.43 kD,pI值为9.22。细胞定位分析显示vscO基因位于外周质,不存在信号肽,无跨膜区。vscO基因具有转录起始区-35区和-10区,以及翻译识别信号SD序列(Shine-Dalgarno sequence)。该氨基酸序列含有多种活性位点,如蛋白激酶C磷酸化位点等。系统进化树发现溶藻弧菌的VscO蛋白与副溶血弧菌聚为同一亚族。VscO亚基三维结构模型显示其与副溶血弧菌T3SS的YscO蛋白有相似构型。信号通路分析推测VscO位于T3SS的针状样结构上。蛋白网络互作图谱发现VscO与10种T3SS蛋白具有相邻关系。本研究结果将为溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统护航机制的研究奠定基础。
- 庞欢瑛周泽军丁燏黄郁葱吴灶和简纪常
- 关键词：溶藻弧菌
- 溶藻弧菌减毒活疫苗的构建及其免疫保护性被引量：3
- 2014年
- 采用Overlap PCR和同源重组技术,结合氯霉素(Cm)正向筛选和sacB基因蔗糖负向筛选,构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白vscO基因无标记框内缺失突变株ZJ03ΔvscO。在以石斑鱼(Epinephelus coioides)为模型的感染实验中发现ZJ03ΔvscO的毒力较ZJ03下降约150倍。将ZJ03ΔvscO作为减毒活疫苗通过注射、浸泡的途径免疫石斑鱼(Epinephelus coioides)后,发现其对溶藻弧菌有很好的保护效应,其中注射组的免疫保护率达84%,浸泡组次之(68%)。血清效价分析显示,免疫后第4周注射组和浸泡组的效价均达到最高值,分别为1:2 048和1︰128。上述结果表明,所构建的ZJ03ΔvscO减毒活疫苗可有效提高石斑鱼对溶藻弧菌的免疫力,并且免疫和攻毒的途径可能是影响免疫保护效果的因子。本研究旨在为溶藻弧菌引起的鱼类疾病防治提供技术支撑。
- 庞欢瑛周泽军丁燏闫秀英蔡双虎简纪常吴灶和
- 关键词：溶藻弧菌减毒活疫苗免疫保护
- 红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化被引量：6
- 2013年
- 克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)末端脱氧核糖核酸转移酶TdT蛋白(Terminal deoxynucleotidyl transferases)成熟肽基因序列,并与pET-32a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-32a-TdT,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。运用传统方法优化诱导条件,以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分析表明,37℃、0.7 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后,TdT融合蛋白的表达量最大,分子质量大小与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式存在。利用HisTrap HP亲和层析柱使TdT蛋白得到进一步纯化,最佳咪唑洗脱浓度为300 mmol/L,Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性的结合,表明表达蛋白为目的蛋白。
- 黄瑜张雪利鲁义善简纪常吴灶和黄浦江周泽军
- 关键词：红笛鲷原核表达纯化WESTERNBLOT分析
- 溶藻弧菌HY9901外膜蛋白OmpH的基因克隆及其生物信息学分析被引量：2
- 2013年
- 根据已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株外膜蛋白OmpH的全长基因。结果显示,该基因(GenBank登录号:JX855924)全长573 bp,共编码190个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子量约为21.1 kD,等电点为9.02。SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SofiBerry-Psite预测结果显示,OmpH不存在信号肽与跨膜区,含有1个N-糖基化位点,6个磷酸化位点,1个内质网靶信号位点以及3个微体C末端靶信号位点。利用MAGE5.0软件,以邻位相连法构建OmpH系统进化树,结果显示,溶藻弧菌OmpH与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)等有较近亲缘关系。采用多种参数成功预测了OmpH可能的B细胞抗原优势表位,分别是第5-10、106-110、120-125、158-163和175-180区段。利用SWISS-MODEL软件,模拟了OmpH亚基三维结构模型,且与其同源蛋白大肠杆菌(Escherichia coli)Skp蛋白有相似构型。
- 周泽军庞欢瑛丁燏简纪常吴灶和
- 关键词：溶藻弧菌基因克隆外膜蛋白生物信息学分析
- 溶藻弧菌转运蛋白TolB的免疫原性与免疫保护性被引量：3
- 2015年
- 旨在研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白Tol B作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的全基因组序列,设计特异性引物PCR扩增tol B的基因全长序列。序列分析显示,该基因(Gen Bank登录号JQ846501)全长1 353 bp,共编码450个氨基酸残基。BLAST分析发现,溶藻弧菌tol B基因与其他已知弧菌的tol B具有较高的同源性,序列保守,可作为共同抗原候选蛋白。用原核表达的tol B蛋白免疫SPF级小鼠,制备多克隆抗体,ELISA效价达1∶40 000。免疫印迹表明鼠抗tol B血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应。为进一步研究tol B对石斑鱼(Epinephelus awoara)的免疫保护性,用Tol B蛋白两次免疫石斑鱼,ELISA检测发现,免疫石斑鱼血清的抗体效价在第4周达到峰值(1∶2 048)。攻毒实验结果表明Tol B对石斑鱼的免疫保护率为76%。结果表明,溶藻弧菌转运蛋白Tol B具有较好的免疫原性和免疫保护性,可作为弧菌亚单位疫苗的候选抗原。
- 庞欢瑛周泽军张燕飞李静邱明生丁燏简纪常吴灶和
- 关键词：溶藻弧菌B基因免疫原性免疫保护
- 溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB的原核表达及条件优化和纯化被引量：7
- 2013年
- 为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB序列(JQ846501),设计1对带酶切位点的引物,PCR扩增tolB基因,然后经酶切、连接等步骤,构建tolB基因的原核表达载体pET-TolB,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白。结果表明:IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901株TolB蛋白,分子量与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在;TolB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为:0.2mmol/L IPTG,37℃诱导4h;最佳咪唑洗脱浓度为400mmol/L。这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础。
- 周泽军庞欢瑛丁燏简纪常吴灶和
- 关键词：溶藻弧菌原核表达纯化
- 溶藻弧菌vscO基因在不同环境下的表达差异被引量：4
- 2014年
- 为阐明溶藻弧菌vscO的在不同环境下的表达情况,用半定量RT-PCR方法检测vscO mRNA在不同生长时期、不同环境因子(温度、盐度和pH值)培养下的相对表达量.结果表明,溶藻弧菌vscO在对数期,温度为28℃,盐度为2%以及培养基起始pH值为7.0时的表达量最高.
- 庞欢瑛周泽军丁燏黄郁葱吴灶和简纪常
- 关键词：溶藻弧菌环境因子基因表达
- 溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白VscO的功能研究
- Ⅲ型分泌系统（Type III secretion system，T3SS）是溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）中一个重要的致病因子，与细菌的致病性密切相关。病原菌粘附到宿主细胞表面后，通过T3SS直接...
- 周泽军
- 关键词：溶藻弧菌
