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敲除PPK基因对幽门螺杆菌逃避巨噬细胞免疫清除的影响被引量：2: 2012年; 目的:研究敲除多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase,PPK)基因后对幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)逃避巨噬细胞免疫清除的影响.方法:通过同源重组的原理构建H.pylori PPK敲除菌株.提取PPK敲除菌株体内多聚磷酸盐,转化为ATP进行定量,并与野生型菌株内多聚磷酸盐水平进行比较.将PPK敲除菌株及野生型菌株分别与小鼠巨噬细胞系RAW264.7共同培养,比较存活的H.pylori数量.结果:成功构建敲除PPK的H.pylori菌种.Western blot显示该菌无PPK蛋白表达.对敲除PPK的H.pylori菌株中的多聚磷酸盐定量结果显示,其内PP含量为0.46±0.25nmol Pi/mg Protein,显著低于G27野生菌种(175.33±21.22nmol Pi/mg Protein,P<0.01).将该菌株与小鼠巨噬细胞系RAW264.7共同培养,2h时间点,G27及G27ΔPPK菌种在巨噬细胞内的存活无显著差异;而在24h时间点,G27ΔPPK菌种在巨噬细胞内的存活率显著低于野生型G27菌种,巨噬细胞内的BacLightkit染色结果显示,G27ΔPPK菌种在巨噬细胞内获得染色的活菌显著低于野生型G27菌种.结论:PPK是H.pylori合成多聚磷酸盐的关键酶.敲除该基因后,H.pylori合成多聚磷酸盐的能力显著下降,其逃避巨噬细胞清除的能力明显减弱.; 杨诏旭路程伊杨宾夏宁窦科峰; 关键词：幽门螺旋杆菌巨噬细胞

一种大鼠肝癌干细胞的离心富集方法被引量：2: 2012年; 目的建立一种富集大鼠肝癌干细胞的方法，并检测此种方法分离得到的细胞是否具有肿瘤干细胞的生物学特征。方法二乙基亚硝胺（DENA）腹腔注射构建大鼠肝癌模型，两步胶原酶灌注法分离肝癌细胞并体外培养，Percoll连续梯度密度离心法将细胞分成4层，采用流式细胞仪检测各层细胞的肝癌干细胞表面标志上皮细胞黏附因子（EpCAM）、甲胎蛋白（AFP）的表达，并用实时一聚合酶链反应（ReM—timePCR）验证EpCAM、CDl33、AFP的mRNA表达。绘制生长曲线检测各层细胞增殖能力，Transwell小室检测各层细胞的侵袭能力。结果Percoll离心所得4层细胞中，第3层细胞是富集肝癌干细胞最多的一层，具有最强的增殖能力。第3层细胞EpCAM与AFP阳性表达最高，分别为（84．50±8．31）％和（85．20±8．31）％，与其他各层比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。经ReM—timePCR验证，第3层细胞的EpCAM和AFPmRNA表达最高，分别为（111．34±5．59）和（13．76±0．95），与其他各层比较，差异有统计学意义（P〈0．05），第3层的CD133表达为（17．16±0．42），与第2层、4层比较，差异有统计学意义（P〈0．05），但与第1层比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。侵袭实验可见第3层细胞穿透的数量最多（92．750±4．432），与其他各层比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论利用Percoll连续梯度密度离心法成功地富集了肝癌干细胞，经验证符合肿瘤干细胞生物学特性，为肝癌的靶向治疗、多重耐药等基础研究提供了确切的研究对象。; 王兴刘卫辉夏宁张娟杨建栋王涛尤楠龚振斌季茹赵戈窦科峰; 关键词：肝细胞干细胞细胞分离

小分子干扰RNA介导的RhoA沉默优化胎肝干细胞培养被引量：3: 2012年; 背景:细胞移植治疗是目前的研究热点之一,寻找良好的细胞来源并有效扩增,是大量临床应用的基础。目的:通过沉默RhoA基因优化胎肝干细胞培养方法。方法:体外培养胎肝干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,分为3组:A组为干细胞组,B组为经随机打乱顺序的小分子干扰RNA转染干细胞组,C组为经小分子干扰RNA转染的干细胞组。应用反转录-聚合酶链反应、Western blot法检测胎肝干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论:转染小分子干扰RNA后C组与A、B组相比,RhoA基因和蛋白表达量明显降低(P<0.05),细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多,各组间差异有显著性意义(P<0.05)。提示通过沉默RhoA基因的方法可以促进胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。; 赵戈刘卫辉王涛王兴夏宁杨平寇明文张宁陶开山; 关键词：胎肝干细胞细胞培养 RHOA

血清及肝组织miR-200a在大鼠肝癌发生过程中的动态表达分析被引量：9: 2014年; 目的分析血清及肝组织miR-200a在肝癌发生过程中的表达水平并将其与传统肝癌血清学标志物甲胎蛋白比较,探索其成为肝癌早期诊断标志物的可能性.方法二乙基亚硝胺腹腔注射诱导建立大鼠肝癌模型,建模过程中收集肝癌发展到各个阶段大鼠血液及肝脏组织.同时,临床收集正常、肝硬化、肝癌患者血液标本.用实时定量PCR技术检测血清miR-200a的相对表达情况,用酶联免疫吸附法检测血清甲胎蛋白动态变化,原位杂交法检测miR-200a在组织中表达情况.体质量数据采用两样本t检验,PCR及酶联免疫吸咐各组数据间采用单因素方差分析进行比较.结果与正常组及纤维化期大鼠相比,miR-200a在肝硬化期、肝癌早期、肝癌晚期的大鼠血清均有不同程度下调(P值均＜0.05),甲胎蛋白在肝癌早期、肝癌晚期的大鼠血清明显上调(P值均＜ 0.05).与肝硬化期大鼠比较,肝癌晚期大鼠体内的miR-200a表达显著下调(P值均＜0.05),甲胎蛋白在肝癌早期、肝癌晚期均显著上调.临床标本分析结果显示,miR-200a在肝硬化及肝癌患者中均显著下调(P值均＜0.05),甲胎蛋白仅在肝癌患者中出现异常表达.原位杂交结果显示,以正常肝组为标准,miR-200a在正常组、纤维化期、肝硬化期、肝癌早期、肝癌晚期中表达水平依次为:1.00％±0.01％、0.37％±0.03％、0.14％±0.01％、0.05％±0％、0.01％±0.00％.结论 miR-200a极大程度地参与了肝癌发生,对于肝癌发生各个阶段均有巨大的指示作用,可能作为肝癌预防和早期诊断的一个潜在标志物.; 夏宁高媛王兴刘卫辉杨建栋王涛赵戈李海民; 关键词：肝肿瘤血清甲胎蛋白类

幽门螺杆菌PPK的纯化与功能分析: 2012年; 目的:表达纯化幽门螺杆菌多聚磷酸激酶,并测定其功能。方法:将幽门螺杆菌多聚磷酸激酶基因克隆入原核表达载体PQE80L中,在大肠杆菌(E.coli)DH5-α中表达。用BD Talon resin纯化目的蛋白。并在体外测定其合成多聚磷酸盐及转化多聚磷酸盐至ATP的能力。结果:成功构建了原核表达载体,得到高表达量的融合蛋白。经BD Talon resin纯化获得较高纯度的His-多聚磷酸激酶N端融合蛋白。体外实验证实该酶可以有效合成不同链长的多聚磷酸盐,并且在适当条件下可将多聚磷酸盐转化为ATP。结论:利用原核表达载体可很好表达幽门螺杆菌多聚磷酸激酶,纯化后的蛋白具有良好生物活性,是一个具备合成多聚磷酸盐及转化其为ATP的双向功能的酶。; 杨诏旭夏宁金成窦科峰; 关键词：幽门螺杆菌多聚磷酸盐

血清miR-21及AFP在大鼠肝癌发生过程中的动态表达比较分析被引量：4: 2012年; 目的:分析血清miR-21在肝癌发生过程中的表达水平并将其与传统肝癌血清标志物甲胎蛋白(AFP)比较,探索其成为肝癌早期诊断血清标志物的可能性。方法:二乙基亚硝胺(DENA)腹腔注射诱导建立大鼠肝癌模型,建模过程中收集造癌各个阶段的血清。Realtime-PCR检测血清miR-21的表达情况,ELISA法检测血清AFP水平。结果:与正常组及纤维化期大鼠相比,miR-21在肝硬化期、肝癌早期、肝癌晚期的大鼠血清均有不同程度上调(P<0.05),AFP在肝癌早、晚期的大鼠血清明显上调(P<0.05);与肝硬化期大鼠比较,肝癌早、晚期大鼠体内的miR-21表达显著上调(P<0.05),AFP在肝癌早期、肝癌晚期均显著上调(P<0.05)。结论:血清miR-21参与了肝癌发生的过程,对于肝癌发生的各个阶段均有很大的指示作用,可能作为肝癌预防和早期诊断的一个潜在标志物。; 王兴张娟夏宁刘卫辉窦科峰; 关键词：肝癌血清 MIR-21 AFP

miR-200a及AFP在肝癌、肝硬化患者血清中表达比较分析被引量：1: 2012年; 目的:分析miR-200a及AFP在肝癌、肝硬化患者血清中的表达水平并进行比较,探索其成为肝癌早期诊断血清标志物的可能性。方法:临床收集肝正常、肝硬化、肝癌患者血液标本。运用实时定量PCR技术检测血清miR-200a的相对表达情况,血清AFP水平从临床资料中提取。结果:临床标本分析结果显示,miR-200a在肝硬化及肝癌患者中均显著下调(P<0.05),AFP仅在肝癌患者中出现异常表达。结论:血清miR-200a极大程度地参与了肝癌发生,对肝硬化及肝癌具有一定的诊断价值。; 夏宁高媛朱春红王兴刘卫辉王涛李海民; 关键词：肝癌血清 AFP

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夏宁

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