刘梦瑶
- 作品数：8 被引量：8H指数：2
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- 鼠OAZ1基因的真核表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达
- 2010年
- 构建鼠OAZ1基因真核表达质粒,观察OAZ1-GFP融合蛋白在绿猴肾细胞COS7中的表达。利用RT-PCR的方法获得鼠OAZ1基因,再利用重叠延伸PCR缺失掉OAZ1序列中的205位碱基T,由此获得无需阅读框移码即可编码全长OAZ1的突变基因。将此突变基因克隆入真核表达载体pEGFP-N1获得重组质粒pEGFP-N1-OAZ1-T。将此质粒瞬时转染COS7后,采用RT-PCR,Western blotting,免疫荧光技术观察检测目的基因的表达情况。结果显示,酶切和测序证明质粒pEG-FP-N1-OAZ1-T构建正确,转染COS7细胞后,OAZ1-GFP融合蛋白能在细胞中高效表达。成功构建了pEGFP-N1-OAZ1-T真核表达质粒,在COS7细胞内,该质粒能成功指导OAZ1-GFP融合蛋白合成。
- 刘梦瑶韩钰蔡富强何玲王艳林
- 关键词：多胺代谢融合蛋白真核表达
- 小鼠OAZ2基因的原核表达及抗体制备
- 2011年
- 目的:克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶2(OAZ2)功能基因,原核表达、纯化OAZ2蛋白并制备抗OAZ2多克隆抗体。方法:RT-PCR法从鼠黑色素瘤细胞总RNA中克隆OAZ2 cDNA后,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因。将OAZ2功能基因克隆入原核表达载体pET15b并原核表达。表达的蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,用SDS-PAGE和West-ern Blot分析鉴定。用纯化的OAZ2蛋白作为抗原免疫Bab/C小鼠以制备多克隆抗体,制备抗体用ELISA和Western Blot检测抗体滴度和特异性。结果:成功获得小鼠OAZ2 cDNA并构建出无需移码翻译的OAZ2功能基因。OAZ2功能基因在大肠杆菌BL21(DE3)中可诱导性高表达并能用Ni-NTA树脂高效纯化。用纯化蛋白免疫Bab/C小鼠制备的抗血清经ELISA检测有较高的多克隆抗体效价(>1:64 000),经Western blot鉴定可与纯化的OAZ2蛋白质特异性结合。结论:建立了鼠OAZ2蛋白原核表达和纯化技术,制备出高效价和特异性抗OAZ2多克隆抗体,为进一步研究OAZ2基因的功能奠定了基础。
- 刘梦瑶韩钰何玲蔡富强王艳林
- 关键词：重叠延伸PCR原核表达抗体
- 基于灰色理论的工程项目管理成熟度模型研究——以输电工程项目为例
- 项目管理成熟度是评价企业项目管理水平高低的工具，随着，农网改造结束城乡电力需求增长，低压电网项目改造等项目突增;跨区域的输电工程投入建设，项目管理能力将受到挑战;国家为实现西电东送、南北互供而主导的全国联网工程，加大了高...
- 刘梦瑶
- 关键词：项目管理成熟度模型输电工程
- 鸟氨酸脱羧酶抗酶融合蛋白高表达对小鼠黑素瘤细胞B16-F1细胞周期的影响被引量：4
- 2011年
- 目的研究鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ)与绿色荧光蛋白融合蛋白GFP-OAZ1和GFP-OAZ2高表达对小鼠黑色素瘤B16-F1细胞周期的影响。方法构建GFP-OAZ1和GFP-OAZ2融合基因的真核表达质粒并经脂质体法瞬时转染B16-F1细胞,然后用Western blot分析法和荧光显微镜下观察融合蛋白在B16-F1细胞中的表达。流式细胞分析用于检测GFP-OAZ融合蛋白高表达对B16-F1细胞周期的影响。Western blot分析法鉴定GFP-OAZ融合蛋白高表达对B16-F1细胞中鸟氨酸脱羧酶(ODC)酶蛋白水平的影响。结果成功构建的GFP-OAZ1和GFP-OAZ2融合基因B16-F1细胞中正确高效表达。经流式细胞检测发现,OAZ1和OAZ2融合蛋白高表达导致细胞G0/G1期阻滞。当用OAZ1和OAZ2分别与ODC共转染B16-F1细胞时,OAZ1融合蛋白高表达显著性减低细胞内ODC蛋白水平,但OAZ2融合蛋白高表达无此种影响。结论成功构建GFP-OAZ1和GFP-OAZ2融合基因的真核表达载体,OAZ1和OAZ2融合蛋白高表达均能将B16-F1细胞阻滞于G0/G1期,但仅OAZ1融合蛋白能显著性促进ODC降解,OAZ2融合蛋白无此种功能。
- 刘梦瑶韩钰蔡富强何玲王艳林
- 关键词：融合蛋白真核表达细胞周期
- siRNA干扰鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1的表达抑制黑素瘤细胞增殖被引量：1
- 2011年
- 目的:研究siRNA干扰鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)的表达对小鼠黑素瘤B16-F1细胞增殖的影响。方法:构建OAZI-1特异性siRNA表达质粒psilencer2.1-U6/OAZI-1及对照psilenc-er2.1-U6/scrambled质粒,脂质体转染法将质粒转染入B16-F1细胞,Western blotting和定量PCR检测B16-F1细胞中OAZI-1的表达。MTT法和流式细胞术检测psilencer2.1-U6/OAZI-1对B16-F1细胞增殖和细胞周期的影响;MTT法检测干扰OAZI-1表达后B16-F1细胞对抗肿瘤药物紫杉醇(docetaxel)的敏感性。结果:成功获得稳定转染psilencer2.1-U6/OAZI-1质粒的B16-F1细胞(B16/OAZI-1细胞),B16/OAZI-1细胞中OAZI-1 mRNA和蛋白表达分别为阴性对照B16/scrambled细胞的25.0%和18.9%。干扰OAZI-1的表达抑制B16-F1细胞的增殖,G0/G1期细胞比例增加[(57.0±0.8)%vs(63.5±0.7)%,P<0.01],而S期和G2/M期细胞比例减少[(31.5±0.7)%vs(27.5±0.3)%,P<0.05;(11.5±0.3)%vs(9.1±0.6)%,P<0.01]。干扰OAZI-1的表达能降低B16-F1细胞对紫杉醇的敏感性。结论:siRNA干扰OAZI-1的表达能抑制黑素瘤B16-F1细胞的增殖,并降低其对紫杉醇的敏感性。
- 何玲韩钰刘梦瑶蔡富强王艳林
- 关键词：RNA干扰技术黑素瘤细胞
- 研究生辅导员角色定位及优化策略研究——以三峡大学为例
- 伴随着研究生招生规模的扩大，辅导员在研究生管理与培养的过程中作用日益显著。研究生辅导员作为高校从事德育工作、开展思想政治教育的骨干力量，是研究生健康成长的指导者和引路人，政府、高校、研究生乃至家长对辅导员承担的角色有着不...
- 刘梦瑶
- 关键词：研究生辅导员角色定位自我认知
- 鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1高表达对小鼠黑素瘤B16-F1细胞增殖的影响被引量：5
- 2011年
- 目的:研究鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)高表达对小鼠黑素瘤B16-F1细胞增殖的影响。方法:采用巢氏PCR法从小鼠肝癌H22细胞cDNA中克隆出小鼠OAZI-1基因,并构建重组质粒pcDNA3.1(+)/OAZI-1。采用脂质体转染法将重组质粒转染入B16-F1细胞后,Western印迹法和实时荧光定量PCR法鉴定高表达OAZI-1的B16-F1细胞株。MTT法和FCM检测OAZI-1高表达对B16-F1细胞增殖和细胞周期的影响。反相高效液相色谱检测OAZI-1高表达对细胞内多胺水平的影响。化学发光法检测细胞内精胺氧化酶(spermine oxidase,SMO)的活性。结果:成功获得高表达OAZI-1的B16-F1细胞克隆株B16/over,该细胞中OAZI-1在mRNA水平的表达量是转染空载体质粒对照组细胞B16/3.1的3.6倍。B16/over细胞中,鸟氨酸脱羧酶抗酶(ornithine decarboxylase antizyme,OAZ)的mRNA表达水平降低,鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)的mRNA表达水平升高。高表达OAZI-1能促进B16-F1细胞增殖,并影响细胞周期,G0/G1期细胞减少而S期和G2/M期细胞增加。B16/over细胞中腐胺的含量明显增加,精脒和精胺的含量减少,而且SMO活性升高。结论:OAZI-1高表达可能通过增加细胞内腐胺含量,促进黑素瘤细胞增殖,提示该抑制蛋白可能成为黑素瘤治疗的一个潜在靶点。
- 何玲韩钰刘梦瑶蔡富强王艳林
- 关键词：鸟氨酸脱羧酶抑制蛋白类细胞增殖
- 小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达
- 2010年
- 目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重叠PCR法扩增出692bp的OAZ1功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合。结论已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因,原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白。
- 刘梦瑶韩钰蔡富强何玲王艳林
- 关键词：功能基因重叠延伸PCR原核表达
