张文晓
- 作品数：8 被引量：18H指数：3
- 供职机构：安徽医科大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 牛乳铁蛋白肽基因的慢病毒载体构建
- 牛乳铁蛋白肽(Bovine lactofericin,简称LfcinB)是一种阳离子生物活性肽,是从牛乳铁蛋白的降解产物中分离得到,其含有25个氨基酸残基(Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-...
- 张晓宇秦宜德王超张文晓王巍何晓光
- 乳铁蛋白抗菌-乳源免疫调节融合肽的表达纯化及其基因对SKOV3细胞的影响
- 2014年
- 目的构建并鉴定牛乳铁蛋白抗菌-乳源免疫调节融合肽(简称LIFP)基因的重组载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达和纯化,获得较高纯度的融合肽;研究LIFP基因体外对卵巢癌细胞SKOV3的影响,为基因治疗卵巢癌提供基础。方法以GENBANK报道的牛乳铁蛋白抗菌肽(LFCINB)与乳源免疫调节肽(PGPIPN)的序列为参照,以连接臂GGGGS连接两种肽,合成融合肽LIFP基因,并在其5’端加入凝血酶FXA识别的酶切位点。将LIFP基因构建到表达载体PGEX-KG中,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定后,采用最优表达条件诱导重组载体在大肠杆菌BL21中表达,超声裂菌后,SDS-PAGE和Western-blot鉴定融合蛋白(LIFP-GST),通过AKTA层析系统纯化融合蛋白,FXA酶切后,高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)鉴定LIFP的表达;将LIFP基因构建到PLJM1载体[含CMV启动子和绿色荧光蛋白(GFP)中,获得PLJM1-LIFP慢病毒表达载体,经PCR检测及测序鉴定后,与慢病毒包装质粒通过LIPOFEETAMINE 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,并测定其滴度;体外培养人卵巢癌细胞SKOV3,重组慢病毒感染细胞后,MTT法观察融合肽对SKOV3细胞的生长抑制作用,HOECHST33258染色观察细胞核形态的变化。结果PCR和测序证实成功构建了PGEX-KG-LIFP重组载体;WESTERN-BLOT结果显示成功诱导LIFP的高表达;HPLC显示获得较高纯度LIFP;MS显示氨基酸序列与目的肽一致;成功构建PLJM1-LIFP慢病毒表达载体,三质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为1.2×108TU/ml;重组病毒感染SKOV3细胞后,MTT结果显示融合肽对体外培养的SKOV3细胞生长具有抑制作用(P<0.05),荧光显微镜观察到凋亡细胞典型的形态学特征。结论成功诱导表达纯化融合肽,并初步证实对体外SKOV3有生长抑制和诱导细胞凋亡作用。
- 张文晓秦宜德
- 关键词：融合肽慢病毒载体
- 卵巢癌细胞中乳源免疫调节肽受体蛋白的筛选被引量：1
- 2012年
- 目的乳源免疫调节肽(PGPIPN)在人卵巢癌细胞株(SKOV3)上进行受体蛋白的筛选。方法异硫氰酸荧光素(FITC)标记PGPIPN,作用于SKOV3观察其细胞定位;从SKOV3中提取作用部位的蛋白;通过NHS-activated亲和层析柱进行分离和纯化受体蛋白质,SDS-PAGE的初步鉴定。结果在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光标记肽结合于SKOV3的胞膜上。通过提取膜蛋白和亲和层析法成功筛选了受体膜蛋白。结论 PGPIPN的作用位点位于细胞膜上,其抗癌作用可能通过胞膜结合蛋白而启动信号转导通路,为进一步探讨其抗癌机制奠定基础。
- 何晓光郑欣任明强张文晓杨浩然魏彩顾芳秦宜德
- 关键词：免疫调节肽受体蛋白
- 乳铁蛋白抗菌-免疫调节融合肽的载体构建及在大肠杆菌中的表达和纯化被引量：3
- 2012年
- 目的构建乳铁蛋白抗菌-免疫调节融合肽(LIFP)表达载体,在E.coli BL21中诱导高表达并进行纯化。方法以乳铁蛋白抗菌肽(LfcinB)与乳源免疫调节肽(PGPIPN)的序列为参照,以连接臂(GGGGS)连接两种肽,设计LIFP基因,并在其5'端设计凝血酶FXa识别的酶切位点。将融合肽基因构建到表达载体pGEX-KG中,转化到E.coli BL21中,用IPTG低温诱导表达,通过AKTA层析系统纯化融合蛋白,Western blot进行鉴定。结果成功构建pGEX-KG-LIFP原核表达载体,并诱导其高表达。通过AKTA蛋白纯化系统,用亲和层析方法纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论成功构建了LIFP表达载体,制备并纯化了LIFP,为进一步研究该肽功能和药物开发奠定基础。
- 张文晓秦宜德何晓光郑欣任明强
- 关键词：免疫调节肽融合蛋白纯化
- 乳铁蛋白抗菌—乳源免疫调节融合肽的表达纯化及其基因对SKOV3细胞的影响
- 目的构建并鉴定牛乳铁蛋白抗菌-乳源免疫调节融合肽（lfcinB-immunostimulating fusion peptide，简称LIFP）基因的重组载体，在大肠杆菌BL21中诱导表达和纯化，获得较高纯度的融合肽；研...
- 张文晓
- 关键词：融合肽慢病毒载体
- 文献传递
- 乳源免疫调节肽体外抑制人卵巢癌细胞侵袭和转移被引量：10
- 2013年
- 目的探讨乳源免疫调节肽(PGPIPN)对人卵巢癌细胞株(SKOV3)侵袭和转移的影响。方法 Transwell小室测定其侵袭力和迁移力,细胞划痕实验测定细胞运动能力,细胞克隆形成实验观察SKOV3的克隆形成能力,用MTT法比较PGPIPN对SKOV3、人正常肝细胞株LO2和小鼠永生化成纤维细胞株(MEFS)的生长抑制情况,检测PGPIPN的细胞毒性。结果 Transwell试验中,与空白对照组相比,浓度为1 mg.L-1和10 mg.L-1的PGPIPN明显抑制了SKOV3的侵袭和转移(P<0.01),抑制率分别为20.20%和23.78%;划痕实验显示对细胞的运动能力得到了明显的抑制;平板法的克隆形成实验结果较明显,与空白对照组相比,1 mg.L-1和10 mg.L-1的PGPIPN抑制率分别为32.50%和38.11%;PGPIPN抑制SKOV3细胞生长,对正常细胞无明显影响。结论乳源免疫调节肽能够抑制人卵巢癌细胞的侵袭和转移。
- 魏彩秦宜德郑欣何晓光张文晓杨浩然
- 关键词：顺铂卵巢癌细胞
- 牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的慢病毒载体的构建及鉴定被引量：4
- 2011年
- 目的构建并鉴定牛乳铁蛋白肽基因LfcinB基因的慢病毒载体,为LfcinB应用于基因治疗奠定了基础,以便进一步研究LfcinB的功能。方法根据GenBank报道的Lf-cinB基因序列,合成LfcinB基因,PCR方法扩增LfcinB基因,与经EcoR 1和Nhe 1酶切后的pljm1载体[含CMV启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接、转化,产生pljm1-LfcinB慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pljm1-Lf-cinB载体、△8.91载体、pvsvg载体三质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞中绿色荧光蛋白GFP的表达水平测定病毒滴度。Western blot检测Lf-cinB的表达。结果 PCR和测序证实成功构建了pljm1-Lf-cinB慢病毒载体。浓缩病毒悬液滴度为2×108 TU/ML。Western blot检测到目的肽成功表达。结论成功构建含LfcinB的慢病毒载体,为进一步感染细胞和基因治疗奠定了基础。
- 张晓宇秦宜德张文晓郑欣何晓光王巍
- 关键词：乳铁蛋白细胞凋亡
- 免疫调节肽对卵巢癌skov3细胞凋亡及相关基因表达的影响被引量：6
- 2012年
- 目的研究免疫调节肽(PGPIPN)对人卵巢癌细胞株skov3凋亡及相关基因表达的影响。方法体外培养卵巢癌skov3细胞,分别使用10-6、10-5、10-4、10-3、10-2g/L的PGPIPN孵育skov3细胞48 h,观察量效关系;通过cDNA芯片技术筛选凋亡相关基因;实时荧光定量PCR法检测Bax、Bcl-xl、Caspase-3 mRNA水平的表达量;Western blot法检测Bax、Bcl-xl、Caspase-3蛋白表达量。结果与对照组相比,Bax和Caspase-3的表达随着PGPIPN浓度升高而升高(P<0.05);Bcl-xl的表达随着PGPIPN浓度升高而降低(P<0.05)。结论 PGPIPN通过促进细胞中Bax及抑制Bcl-xl的表达来调控skov3细胞的凋亡,该过程可能和Caspase的活化相关。
- 郑欣何晓光张文晓杨浩然魏彩顾芳任明强秦宜德
- 关键词：免疫调节肽CDNA芯片BAXBCL-XL
