王利华
- 作品数：5 被引量：10H指数：1
- 供职机构：上海交通大学医学院附属瑞金医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市教育委员会重点学科基金上海市科技人才计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 氯化钴诱导心肌细胞化学性缺氧HIF-1α表达的研究被引量：8
- 2013年
- 目的：观察不同浓度的氯化钴（CoCl2）对H9C2心肌细胞的影响及其诱导化学性缺氧的最佳浓度和时间。方法：用100、300、600、900、1200μmol／L的CoCI2处理H9C2心肌细胞，建立化学性缺氧诱导心肌细胞损伤的实验模型，分别于12、18、24、36、48h用Hoechst33342细胞核染色法检测心肌细胞凋亡：CCK-8试剂盒检测心肌细胞存活率；确定最佳诱导浓度600μmol／L后，分别于0、3、6、9、12、18、24、36、48h采用蛋白印迹法检测缺氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白的表达；确定最佳诱导时间后，用蛋白印迹法检测100、300、600、900、1200μmol／LCoCl2处理H9C2心肌细胞12h后HIF-1α蛋白的表达情况。结果：在600～1200μmo1／L浓度范围内，CoCl2呈剂量依赖性地抑制H9C2心肌细胞的存活。600μmol／LCoCl2诱导12h后H9C2心肌细胞产生明显凋亡．诱导12～48h范围内．12h时H9C2心肌细胞表达的HIF-1α蛋白最高：100～1200μmoI／LCoCl2诱导H9C2心肌细胞12h．其中600μmol／LCoCl2诱导时H9C2心肌细胞表达的HIF-α蛋白最高。结论：CoCl2诱导H9C2心肌细胞化学性缺氧的最佳浓度为600μmol／L．此时最佳时间为12h。
- 石朔王利华郭睿张敏苗莹张淼李彪
- 关键词：氯化钴化学性缺氧缺氧诱导因子1ΑH9C2心肌细胞
- 重组HIF—1α及NIS慢病毒表达载体的构建及功能鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的构建肌凝蛋白轻链-2（MLC-2v）启动下HIF-1α及人NIS慢病毒真核表达载体，探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性。方法应用基因重组技术构建慢病毒（Lv）-延长因子（EF）1-HIF-1α-内部核糖体进入位点（IRES）-NIS及Lv-MLC-HIF-1α-IRES-NIS慢病毒表达载体。对重组质粒进行酶切、测序鉴定后，采用脂质体转染法将重组质粒转入Hela细胞。细胞免疫荧光及Westernb1a分别验证HIF-1α及NIS蛋白在细胞中的定位及定量表达；制备重组病毒，分别以不同的感染复数（MOI）感染H9C2大鼠心肌细胞、NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞和L6大鼠骨骼肌成肌细胞，Westernb1a确定最佳MOI并验证MLC·2v启动子的特异性；分别行H9C2细胞动态摄碘和NaClO4抑制实验。采用两样本t检验分析数据。结果成功构建Lv-EFl-HIF-1a-IRES-NIS及Lv-MLC-HIF-1α-IRES-NIS慢病毒表达载体。2种质粒分别转染Hela细胞，免疫荧光显示HIF-1α蛋白表达于胞质，NIS蛋白表达于胞膜；Westernb1a显示EFl启动下2种蛋白质的表达量多于MLC-2v启动下相应表达。Westernb1a蛋白检测后测定蛋白灰度值，阳性对照组NIS及HIF-1α灰度值分别为69-8和71-9，EF1启动下分别为109-4和92-7，MLC-2v启动下分别为141-9和132-4。Lv-MLC-HIF-1α-IRES-NIS病毒感染H9C2细胞，MOI为20时NIS蛋白表达最高，为最佳MOI。2种病毒以MOI为20分别感染H9C2、NIH-3T3及L6细胞，Westernb1a显示EF1启动下NIS蛋白在3种细胞中均有表达，灰度值分别为23.4、29.8和28.6，相差较小。MLC-2v启动下仅H9C2细胞中有大量NIS蛋白表达，NIS蛋白在H9C2、L6及NIH-3T3细胞的灰度值分别为157.9、178.8和2173。H9C2细胞的摄碘高峰时间为40min，峰值为4287.2计数·min-1，是阴性对照组（254.g计数·min-1）的16.85倍（t=5.34，P〈0.01）。摄碘可被NaC国O4抑制，抑制率达85.5％（t=21.3，P〈0.01）。结论MLC-2v可启动治疗基因HIF
- 石朔郭睿王利华张敏张淼苗莹李彪
- 关键词：缺氧诱导因子1Α亚基碘转运体
- 治疗基因VEGF和报告基因NIS共表达载体的构建和鉴别
- 目的通过引入内部核糖体进入位点(IRES)序列,构建含有血管内皮生长因子(VEGF_(165))和人钠碘同向转运体(hNIS)的真核分泌载体pIRES-VEGF-NIS。体外检测NIS蛋白和VEGF蛋白在HEK293细胞...
- 王利华张淼石朔
- 重组NIS基因腺病毒的制备及在心肌细胞中的特异表达被引量：1
- 2012年
- 目的构建肌凝蛋白轻链-2（MLC-2v）启动子调控的NIS腺病毒载体，探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性。方法将MLC-2v启动子和NIS基因亚克隆至腺病毒穿梭载体，再与含有骨架质粒（pAdEasy-1）的大肠杆菌（BJ5183）同源重组，经人胚肾细胞（HEK293）包装并扩增得到重组腺病毒Ad-MLC-NIS，同时构建巨细胞病毒（CMV）启动子调控的腺病毒Ad-CMV-NIS、仅含有启动子的腺病毒Ad-MLC和仅含有NIS基因片段的腺病毒Ad．NIS作为对照组。腺病毒体外感染心肌细胞和非心肌细胞，通过Westernblot检测NIS蛋白的表达，行动态摄碘及NaCl0。摄碘抑制实验观察NIS蛋白的功能和特性。通过台盼蓝染色实验检测腺病毒感染及NIS摄碘情况对心肌细胞活力和增殖的影响。结果成功构建重组NIS腺病毒。Westernblot检测示感染Ad-CMV-NIS的心肌细胞和非心肌细胞均呈NIS蛋白高表达；感染Ad-MLC．NIS的非心肌细胞出现微量蛋白表达，而心肌细胞中NIS蛋白高表达。动态摄碘实验示感染Ad-MLC-NIS的H9C2细胞、A549细胞、U87细胞摄碘峰值分别为5844．0、833．6、846．0放射性计数·min-1。H9C2细胞的摄碘被NaC10。抑制。感染复数（MOI）为100的腺病毒感染心肌细胞，感染和摄碘实验对心肌细胞活力和增殖的影响较小。结论MLC-2v启动子调控的腺病毒载体可使外源基因NIS在心肌细胞内特异性表达，表达的NIS蛋白具有摄碘功能，为NIS在心肌中作为报告基因的研究奠定了基础。
- 王利华张淼郭睿石朔李彪
- 关键词：腺病毒心肌
- 治疗基因VEGF_(165)和报告基因NIS共表达载体的构建和鉴定
- 2011年
- 目的:利用内部核糖体进入位点(IRES)序列,构建含有血管内皮生长因子(VEGF165)和人钠碘同向转运体(NIS)的真核双表达载体pIRES-VEGF165-NIS,并在体外检测NIS蛋白和VEGF165蛋白在HEK293细胞中的表达。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增得到目的基因VEGF165和NIS,通过酶切将其连接克隆至pIRES载体以构建pIRES-VEGF165-NIS质粒,再通过脂质体将构建好的质粒转染入HEK293细胞,并采用蛋白印迹法和免疫荧光法检测VEGF165和NIS蛋白的表达。结果:成功构建了双基因双表达载体pIRES-VEGF165-NIS,且其受巨细胞病毒(CMV)极早期基因启动子调控。蛋白印迹法检测显示,VEGF165和NIS可同时在HEK293细胞中表达,而免疫荧光显示转染的HEK293细胞可同时表达VEGF165蛋白和NIS蛋白。结论:IRES序列调控VEGF165和NIS双基因可在细胞中同时独立表达,为进一步构建双基因表达重组腺病毒,并利用人NIS作为报告基因,实时监测VEGF165治疗基因的表达和分布奠定基础。
- 王利华张淼石朔郭睿李彪
- 关键词：治疗基因报告基因钠碘同向转运体共表达
