马高峰
- 作品数：11 被引量：19H指数：3
- 供职机构：南方医科大学南方医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金南方医科大学南方医院院长基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组hGM-CSF在乳酸链球菌中的表达及其活性检测
- 目的重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌并检测其蛋白活性。方法乳链菌表达系统 pPUS 的构建：按照 Genbank 公布的序列,选用适合于乳链菌中使用的 p59启动子作为启动子,选用乳链菌分泌型蛋白45(USP...
- 马高峰张振书陈学清
- 文献传递
- 体外拼装凋亡素基因被引量：7
- 2005年
- 目的以凋亡素基因为例,探讨用寡核苷酸片段体外拼装基因的方法。方法按已知的凋亡素基因序列(GeneBank登录号:AY171617),设计40bp的凋亡素基因寡核苷酸片段,并将其中的172位(BglII,agatct→agatcc)和306位碱基(HindIII,aagctt→aatcct)进行同义突变,Taq消除这两个酶切位点。在pfu酶的PCR系统中,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增。产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEM-Teasy载体中。阳性克隆经测序鉴定。结果凋亡素基因寡核苷酸片段第1次PCR拼装后,产物呈拖尾状。但产物经进一步稀释,并用两未端引物进行2次扩增后,即可见明确的产物带及其他梯形带状产物。目的产物TA克隆后,筛选得到阳性克隆,其经测序鉴定,与设计的凋亡素基因序列完全一致。结论体外基因拼装法是一种非常有效的基因克隆方法,可用于基因或载体的合成,及一次性对基因进行广泛的突变。
- 陈学清王亚东孙勇段佑才马高峰
- 关键词：凋亡素聚合酶链式反应
- Egr-1基因剔除减少炎性相关因子在实验性胰腺炎中的表达被引量：5
- 2007年
- 目的:探讨Egr-1基因剔除对实验性胰腺炎小鼠胰腺组织中炎性相关因子表达的影响。方法:利用Egr-1基因剔除小鼠,采用大剂量雨蛙素诱导的实验性胰腺炎模型,观察Egr-1基因剔除后,胰腺组织水肿、MPO水平、血清淀粉酶水平、肺组织MPO水平的改变。并利用定量PCR的方法,检测胰腺组织中炎症相关因子组织因子(TF)、纤维蛋白溶酶原激活因子抑制因子(PAI-1)、单核细胞趋化吸引蛋白1(MCP-1)、Gro-1、IL-6和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达。结果:Egr-1基因剔除小鼠胰腺组织水肿明显轻于野生型,但组织MPO水平与血清淀粉酶与野生型组间相比无明显差异;肺组织MPO水平明显低于野生型。定量PCR检测结果表明,Egr-1基因剔除组,胰腺组织中TF、PAI-1,以及MCP-1、ICAM-1和IL-6 mRNA的表达,明显少于野生型组。结论:Egr-1基因剔除可明显减轻急性胰腺炎的严重程度,其作用可能通过减少胰腺组织中TF、PAI-1,以及MCP-1、ICAM-1和IL-6的表达而实现。
- 段佑才姜泊马高峰徐智民陈晓文程天明戴益琛陈学清
- 关键词：胰腺炎基因敲除
- 乳链菌表达hGM-CSF基因的拼装及其载体pNCSF构建
- 2007年
- 目的体外拼装适合在乳酸链球菌表达的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,hGM-CSF),并构建载体pNCSF。方法根据hGM-CSF的氨基酸序列及乳酸链球菌偏好的密码子,将hGM-CSF基因外显子的全长碱基序列用DNAWORKS程序设计成16条互补的寡核苷酸片段,并且分别在第1条和第16条寡核苷酸片段上分别设计PstⅠ和BamHⅠ酶切位点,将相同终浓度的寡核苷酸混合进行PCR反应,完成hGM-CSF基因拼接,得到目的基因片段,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增,产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEMTeasy载体中,经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证。然后亚克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体。结果通过PCR得到420左右目的DNA片段,获得了hGM-CSF和pNCSF阳性克隆,其DNA测序结果与设计序列完全一致。结论运用基因拼装及克隆技术成功拼装了hGM-CSF基因及构建了载体pNCSF,为乳酸链球菌表达重组hGM-CSF奠定了基础。
- 马高峰张振书杨晓强武金宝陈学清
- 关键词：粒-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌基因克隆
- 化学药物治疗大肠癌的研究进展
- 综合国内外大肠癌化学治疗方面的研究文献,介绍化学药物治疗大肠癌方面的最新进展。5-FU 治疗大肠癌有40多年的历史,至今仍是治疗大肠癌的主要药物,也是研究最多的抗大肠癌的药物,其药代学和药动学也是研究最为清楚,在治疗方面...
- 宋于刚武金宝南清振马高峰王继德
- 文献传递
- 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌表达载体的构建
- 2007年
- 目的:构建重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌表达载体,为进一步研究人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在乳链菌的表达及其治疗价值奠定基础。方法:实验于2005-04/2006-03在南方医科大学南方医院消化病研究所完成。①载体pNCSF的构建:将质粒集落刺激因子及含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000质粒分别加入BamH Ⅰ和Pst Ⅰ进行双酶切,并用Apa Ⅰ、Sac Ⅰ进行双酶切鉴定,重组质粒命名为pNCSF。②SDGFP的TA克隆及载体pNCSFGFP的构建:将经过优化适合在乳链菌表达的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF;同时设计上下游引物经PCR扩增增强荧光表达蛋白(EGFP),TA克隆后经测序验证,再连接于pNCSF获得重组质粒pNCSFGFP。③载体pTRCSF、pTRCSFGFP的建立:将获得的pNCSF和pNCSFGFP进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,以获得人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳链菌表达载体pTRCSF及pTRCSFGFP。结果:①载体pNCSF构建结果:酶切鉴定产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳后,发现有(含启动子P59、信号肽USP45、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)720bp的目的片段。②SDGFP的TA克隆及载体pNCSFEGFP的构建结果:SDGFP阳性克隆产物经EcoRⅠ酶切鉴定得到775bp目的片段。pNCSFEGFP酶切鉴定产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳后,发现有(含启动子P59、信号肽USP45、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、SDGFP)1495bp的目的片段。③穿梭质粒pTRCSF、pTRCSFGFP酶切鉴定结果:经Xba Ⅰ、Sac Ⅰ进行双酶切鉴定,分别得到约717bp、1492bp大小目的片段。结论:获得了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳链菌表达载体pTRCSF及pTRCSFGFP,并经酶切鉴定和测序证实。
- 马高峰张振书杨晓强武金宝陈学清
- 关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子遗传学链球菌属基因表达
- 大鼠急性肠道损伤动物模型的建立被引量：2
- 2007年
- 目的:用三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)复制大鼠急性肠道损伤的动物模型.方法:SD大鼠64只随机分为制模组、制模对照组及正常对照组,分别用TNBS(乙醇稀释)、500 mL/L乙醇及生理水灌肠;观察各组大鼠制模后的粪便、精神状态、进食及存活情况;分别在第1、3、5、7及10天处死大鼠,取结肠组织,进一步观察肠道的大体病理变化和组织病理变化;再结合病理评分,总结大鼠TNBS制模后肠道病理改变的规律,评价该模型用于实验性肠道损伤研究的可行性.结果:TNBS制模组在制模后第1天即表现出明显的肠道稀便和血便,持续至实验结束;进食减少、懒动、畏寒,持续7-10 d后缓解;4只在制模后第7-9天死亡(4/34);制模后第1天即出现肠道病理改变,第5天出现急性肠道损伤,第7天病理改变最严重.制模对照组大鼠在制模后第1天部分出现稀便,持续1-2 d后消失;制模后第1天肠道出现轻度病理改变,3 d后病变减退;正常对照组大鼠未见异常,各组大鼠肠道病理评分与病变程度一致.结论:大鼠TNBS制模后早期即表现出肠道损伤,制模后第7天病理改变达到高峰,此后向慢性炎症转化:TNBS制模后5 d内可用于急性肠道损伤的实验性研究.
- 邢锐马高峰杨晓强武金宝陈学清张振书
- 关键词：肠道损伤三硝基苯磺酸动物模型
- 靶向抑制存活素基因对大肠癌细胞SW80侵袭和转移的实验研究被引量：3
- 2007年
- 目的构建靶向存活素(survivin)基因的短发夹干扰RNA(shRNA)表达载体,导入人大肠癌细胞SW480中,研究靶向抑制survivin基因对SW480细胞侵袭和转移的影响。方法根据siRNA设计原则,在survivin序列中选取设计含19个核苷酸(19nt)的靶序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制survivin基因的sihNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo-survivin;采用Lipofectamine2000TM转染试剂将干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-survivin导入到大肠癌细胞SW480中;用Westernblotting从蛋白水平检测干扰效果;分别采用肿瘤侵袭粘附实验和明胶酶谱分析法检测pRNAT-U6.1/Neo-survivin对SW480细胞的侵袭和转移潜能的影响。结果Survivin基因的蛋白表达均得到显著抑制;沉默SW480的survivin基因可以显著抑制SW480细胞的侵袭和转移潜能,而且survivin基因表达被抑制后,SW480细胞分泌基质金属蛋白酶明显减少。结论Survivin基因可能在SW480的侵袭和转移潜能中起重要作用,沉默SW480的survivin基因可以显著抑制其侵袭、转移和基质金属蛋白酶分泌,因而survivin影响SW480的侵袭和转移可能与调控基质金属蛋白酶分泌密切相关。
- 武金宝南清振马高峰龚伟陈琳林英卓王继德张宏权宋于刚
- 关键词：大肠肿瘤SW480细胞基质金属蛋白酶-2
- 艰难梭菌毒素A羧基端基因原核表达载体的构建及生物信息学分析被引量：1
- 2006年
- 目的构建表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因的原核表达载体。方法PCR扩增艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因(CDTAR),并将其克隆到表达载体pET-22b(+),重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),重组载体经EcoR I,Xho I双酶切鉴定及测序进行分析,并以生物信息学软件分析其生物活性。结果构建了含CDTAR的重组质粒pET-CDTAR,生物信息学分析示该序列具有良好的抗原性及疏水性。结论艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因原核表达载体的构建为艰难梭菌疫苗的研究奠定了基础。
- 杨晓强彭春秀马高峰陈学清姜泊
- 关键词：艰难梭菌基因
- 重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证被引量：1
- 2008年
- 目的运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌,并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株。方法将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达。结果获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实,酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF。结论运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床应用价值打下了基础。
- 马高峰陈学清杨晓强武金宝张振书
- 关键词：粒-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌基因克隆重组质粒蛋白表达
