陈恩祥
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
- 供职机构：西南大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家杰出青年科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 家蚕卵黄原蛋白受体(BmVgR)的表达调控机制研究
- 昆虫作为最大的动物类群，在地球上已经生存繁衍了4亿多年。超强的繁殖能力是亿万年里昆虫为适应诸多生态环境的变化，并保持种群兴盛所进化出的重要“绝技”之一。而该项技能与雌性昆虫个体独特的卵巢管结构和复杂的卵子发生过程紧密相关...
- 陈恩祥
- 关键词：家蚕卵子发生MICRORNA
- 文献传递
- 家蚕卵黄原蛋白受体BmVgR的体外表达被引量：1
- 2014年
- 【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR),分析其在昆虫细胞中的表达特征,了解正常VgR和突变VgR的表达模式,为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物,扩增的目的片段连接到载体pET28a上,构建原核表达载体,转化E.coil BL21(DE3)表达菌株,IPTG诱导获得目的蛋白;用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白;将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的兔源多克隆抗体;PCR扩增获得大造和突变型白妙卵(scanty vitellin,vit)的LBD1+EGF1结构域(C11D和C11V)片段,连接到细胞表达载体上,通过细胞转染表达目的蛋白,采用细胞免疫组化检测大造和突变型vit的VgR在细胞里的表达情况;通过Western blot检测细胞培养液中大造和突变型vit VgR的表达量。【结果】原核表达获得了一个大小约为22 kD的融合蛋白,以包涵体形式表达;镍柱亲和层析初纯化得到BmVgR的肽蛋白,进一步切胶纯化后,以此为抗原制备BmVgR的兔源多克隆抗体,其抗体效价>1﹕512 000,纯度为95%以上。转录水平检测表明Sf9和Spli221昆虫细胞中没有BmVgR和BmVg内源基因的表达;在Sf9昆虫细胞中成功表达了家蚕野生型和突变型vit BmVgR的结构域SP+LBD1+EGF1肽段,家蚕突变型vit在BmVgR第1个表皮生长因子同源区域的第3个ClassB区域有编码50个氨基酸残基的核酸序列缺失;细胞免疫组化试验表明,突变型和正常型的C11V和C11D都能在Sf9细胞质中正常表达;制备的BmVgR兔源多克隆抗体和Myc标签抗体同时检测到细胞表达的目的蛋白,表明试验所制备的VgR抗体特异性较好;由于SP+LBD1+EGF1肽段存在信号肽,细胞表达的蛋白会分泌进入细胞培养液中,Western blot对培养液进行蛋白检测,表明突变型vit存在氨基酸缺失,但并不影响肽蛋白的正常表达,且表达量没有明显差异。【结论】EGF1结构域的缺失并不影响SP+LBD1+EGF1肽蛋白的
- 罗娟陈恩祥刘红玲彭芷昕杨从文沈关望张海燕邢润苗林英夏庆友
- 关键词：家蚕原核表达细胞表达
- 家蚕化蛹初期血液中卵黄原蛋白BmVg的纯化和鉴定被引量：1
- 2014年
- 卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)是昆虫血液中发现最早的蛋白质,对于昆虫的繁殖至关重要。以家蚕Vg基因(BmVg)的部分序列构建原核表达载体,转化E.coil BL21(DE3)菌株,在20℃条件下用0.6 mmol/L IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析纯化得到家蚕卵黄原蛋白BmVg的肽蛋白。以BmVg肽蛋白为抗原制备的兔源多克隆抗体效价>1∶512 000。采用硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析的纯化方法,从家蚕化蛹初期的血液中纯化获得天然的BmVg蛋白,并用制备的多克隆抗体进行Western blotting检测,鉴定此纯化的天然蛋白质为BmVg蛋白。建立的BmVg分离纯化技术将有助于进一步研究BmVg的合成、转运及利用机制。
- 罗娟彭芷昕陈恩祥刘红玲杨从文沈关望张海燕侯勇林英夏庆友
- 关键词：家蚕卵黄原蛋白原核表达分离纯化免疫印迹法
- 家蚕卵黄原蛋白(BmVg)基因启动子的克隆与活性鉴定
- 2014年
- 卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)在家蚕蛹期脂肪体高量表达,研究家蚕卵黄原蛋白基因(BmVg)的转录调控机制及启动子活性,将有助于利用家蚕蛹生物反应器高效表达外源蛋白。设计特异引物,以家蚕蛹基因组DNA为模板PCR扩增得到BmVg长约1.5 kb的启动子片段。构建由不同长度截短BmVg启动子片段驱动荧光素酶报告基因表达的细胞转染载体pGL3-Vg Promoter,分析转染家蚕胚胎培养细胞BmE-SWU1中的BmVg启动子片段活性,结果显示最低截短至BmVg基因翻译起始位点上游90 bp的启动子片段具有转录活性。进一步用截短法分析不同长度启动子的活性,当启动子-752^-952 bp、-42^-152 bp区域被截掉后,启动子的转录活性明显降低,暗示这2个区域内可能存在与启动子启动效率相关的重要调控元件。
- 杨从文沈关望张海燕彭芷昕陈恩祥邢润苗刘红玲韩超珊林英
- 关键词：启动子克隆家蚕蛹
