孙亚丽
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
- 供职机构：第三军医大学西南医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学环境科学与工程更多>>
- 内毒素结合肽及其突变体的表达、纯化及抗内毒素活性研究
- 目的对内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)及其突变体在 E coli DH5 α进行表达,纯化后鉴定其生物学活性。方法将含有 pinpointXa3-EBP 及其突变体 pinpoi...
- 孙亚丽刘友生杨海捷王长松马建洲
- 文献传递
- 内毒素结合肽的改良、原核表达及纯化被引量：1
- 2006年
- 目的:对人内毒素结合肽(endotoxinbindingpeptide,EBP)进行改良,获得突变体mEBP(mutateofendotoxinbindingpeptide,mEBP)基因并进行原核表达,纯化获得高纯度的mEBP。方法:应用PCR定点诱变方法获得mEBP基因,构建PinpointXa3/mEBP融合表达载体,在BL21(DE3)pLysS宿主菌进行表达,溶菌酶裂解法提取包涵体,融合蛋白经PinpointTMXa纯化后,由factorXa酶切,获得目的肽,RPHPLC纯化获得高纯度的mEBP。结果:应用PCR定点诱变技术完成了EBP第5,18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变,且通过原核表达,色谱纯化获得了高纯度的mEBP。结论:成功获得高纯度的mEBP,为下一步的抗内毒素功能检测奠定基础。
- 孙亚丽刘友生杨海捷
- 关键词：突变纯化
- 人内毒素结合肽基因的突变及突变体蛋白表达
- 2006年
- 目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达。方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5、18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变。并将其克隆至原核融合表达载体pinpointXa-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达,经Western blot鉴定。结果突变EBP基因13及52位核苷酸由C突变为A,构建的阳性重组子经酶切及测序鉴定证实与设计序列完全一致,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达生物素化的融合蛋白,Western blot鉴定显示能与抗生物素单克隆抗体结合。结论已成功获得EBP基因突变体,并在大肠杆菌以融合蛋白的形式进行表达。
- 孙亚丽刘友生王长松
- 关键词：突变蛋白表达
- 内毒素结合肽及其突变体的表达纯化和抗内毒素／脂多糖活性研究被引量：3
- 2006年
- 目的使内毒素结合肽(EBP)及其突变体mEBP在E．coli DH5α中表达,纯化后鉴定其抗内毒素／脂多糖(LPS)活性。方法(1)将含PinpointXa3-EBP及其突变体PinpointXa3-mEBP的工程菌DH5α活化,加入异丙硫半乳糖苷(IPTG)诱导其表达生物素融合蛋白。分离纯化表达产物,因子Xa酶切融合蛋白分离目的肽EBP和mEBP。采用亲和层析及反相高效液相色谱法纯化目的肽,用氨基末端10个氨基酸残基序列分析法鉴定突变体mEBP。(2)分离正常人外周血单核细胞(PBMC),用5 mg／L异硫氰酸荧光素(FITC)-LPS+不同浓度EBP或mEBP(均为2．0、5．0、12．5 mg／L)刺激PBMC,检测其平均荧光强度。用1 mg／L LPS+3种浓度(同前)EBP或mEBP刺激PBMC,5 h后取上清液,检测肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素(IL)6浓度。(3)将25只昆明小鼠分为正常对照组(5只):腹腔注射等渗盐水0．2 ml;模型组(5只):小鼠造成20％TBSAⅢ度烧伤,伤后腹腔注射LPS(1 mg／kg);治疗组(15只):小鼠同前致伤后,腹腔注射多黏菌素B(PMB,5 mg／kg)或EBP或mEBP(后两者均为10 mg／kg)。6 h后检测各组小鼠血清TNF-α、IL-6浓度及肝组织中TNF-αmRNA的表达水平。结果(1)纯化后的目的肽EBP、mEBP纯度均达98％以上,mEBP氨基末端10个氨基酸残基序列分析符合预期结果。(2)随着mEBP或EBP浓度的增加,PBMC表面的平均荧光强度逐渐减弱;且在同一浓度下,加入mEBP后平均荧光强度的减弱程度较加入EBP明显。与用1 mg／L LPS刺激PBMC比较,加入1 mg／L LPS+12．5 mg／L EBP以及1 mg／L LPS+3种浓度mEBP刺激后, PBMC培养上清液中IL-6及TNF-α的水平均明显降低(P<0．01)。(3)与模型组比较,治疗组小鼠血清IL-6、TNF-α水平均明显降低(P<0．01),其中10 mg／kg mEBP治疗组两指标低于等浓度EBP治疗组(P<0．05)。(4)小鼠肝组织TNF-αmRNA表达水平:正常对照组相对灰度值为0．25,模型组为0．93,10 mg／kg mEBP治疗组为0．51,10 mg／kg EBP治疗组为0．77,5 mg／kg PMB
- 孙亚丽刘友生杨海捷王长松马建洲
- 关键词：内毒素类突变体
