卢雪花
- 作品数：6 被引量：44H指数：4
- 供职机构：中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室更多>>
- 发文基金：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 香蕉内生拮抗细菌KKWB-5的几丁质酶在大肠杆菌中的表达纯化与复性研究
- 2013年
- 将香蕉内生拮抗细菌KKWB-5的几丁质酶在大肠杆菌中的表达,旨在检测该酶对香蕉枯萎病病原菌4号小种的抗性。PCR扩增该基因连入大肠杆菌表达载体pET22b,导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组菌株,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达,对目的蛋白进行纯化,并将纯化后的目的蛋白复性,对复性产物进行水解几丁质活性和拮抗香蕉枯萎病活性的分析。SDS-PAGE分析表明目的蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式大量表达,经变性Ni2+柱纯化得到了高纯度的重组蛋白,表达量达293 mg/L;稀释和透析2种复性方法中,透析复性法的目的蛋白得率较高,为84.6%。复性后的目的蛋白具有水解几丁质的活性,同时对香蕉枯萎病病原菌也具有一定的抗性,但抗性较弱。该几丁质酶在大肠杆菌中得到高效表达,且复性后的几丁质酶对香蕉枯萎病病原菌4号小种有一定的抑制作用,该酶对KKWB-5菌株拮抗香蕉枯萎病菌的能力有一定的贡献。
- 夏启玉顾文亮卢娟张欣卢雪花王宇光
- 关键词：拮抗细菌几丁质酶表达纯化复性
- 一株拮抗香蕉枯萎病的内生细菌的分离及其几丁质酶基因信号肽的分泌活性分析被引量：10
- 2010年
- 目的:旨在分离并选择一株香蕉内生细菌作为内生基因工程生防菌,并克隆其几丁质酶基因的信号肽序列。方法:从香蕉植株杆下部分离并选择了一株拮抗香蕉枯萎病且具有分泌几丁质酶能力的内生细菌,对该菌株进行了形态观察、生理生化测定和16SrDNA序列分析,克隆了其几丁质酶基因的编码序列并预测了其信号肽,构建了含有信号肽和不含信号肽的几丁质酶的表达菌株BL-chi1和BL-chi2。结果:结合形态观察、生理生化特征和16SrDNA序列比对分析确定该菌株为Klebsiella属,将该菌株命名为KKWB-5;BL-chi1和BL-chi2经IPTG诱导后,均表达了与预期蛋白大小一致的蛋白,同时BL-chi1诱导后的培养基上清中出现一条约45kDa的条带,而BL-chi2和空载体的BL-pET22b诱导后的培养基上清中均无此条带;几丁质水解试验发现,BL-chi1诱导后的培养基上清中的蛋白经浓缩和纯化后都能在几丁质平板上形成透明水解圈。结论:该几丁质酶的信号肽能被BL21(DE3)所识别,将几丁质酶分泌到培养基中,并且分泌的几丁质酶具有水解几丁质的生物学活性。内生菌KKWB-5的分离及其几丁质酶分泌信号肽序列的克隆为进一步构建内生工程菌来防治香蕉枯萎病打下了基础。
- 夏启玉王宇光孙建波卢雪花顾文亮
- 关键词：香蕉枯萎病内生细菌克雷伯氏菌几丁质酶信号肽分泌活性
- 香蕉内生克雷伯氏菌KKWB-5强启动子片段的分离及鉴定被引量：3
- 2011年
- 目的:旨在获得香蕉内生克雷伯氏菌KKWB-5的强启动子片段,以应用于香蕉内生工程菌的构建。方法:利用以kanr基因为报告基因的启动子探针载体pUCK在大肠杆菌Top10中克隆KKWB-5基因组DNA的启动子片段;将筛选到的高抗Kan的质粒导入KKWB-5,分别于LB和香蕉杆浸汁培养基(BSM)平板上检测它们的抗Kan水平;选择在BSM上抗Kan水平最高的片段15,检测该片段的基因间隔区15P的启动子活性,最后以gfp为报告基因来验证片段15P的启动子活性。结果:有7个抗Kan水平在2500μg/ml以上的Top10转化子;这7个质粒在导入KKWB-5后,它们在LB平板上的抗Kan水平有不同程度的增加,但在BSM培养基上则大为减弱;片段15P具有启动kanr基因的活性,且与原片段15的抗Kan水平相同;重组质粒pUCK-6-15Pgfp,以Top10和KKWB-5为宿主菌,在LB培养基上培养时,在荧光显微镜下均能发出绿色荧光;以KKWB-5为宿主菌,在BSM培养基上培养时,在荧光显微镜下也能发出绿色荧光。结论:片段15不仅在Top10中具有较强的启动子活性,而且在其供体菌KKWB-5中具有更强的启动子活性,其基因间隔区15P为主要的启动子区域,在BSM培养基上也具有较好的启动子活性,该启动子片段15P可以应用于KKWB-5内生工程菌的构建。
- 夏启玉孙建波顾文亮卢娟卢雪花王宇光张欣
- 关键词：肺炎克雷伯氏菌启动子GFP
- 紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株被引量：5
- 2010年
- 本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。
- 王宇光雷禄旺孙建波卢雪花夏启玉张昕
- 关键词：紫外诱变
- 拮抗香蕉枯萎病菌的解淀粉芽孢杆菌LX1菌株的鉴定及其抗菌蛋白基因的克隆被引量：21
- 2013年
- 收集海南不同盐碱地的土样进行拮抗香蕉枯萎病菌的微生物分离,对具有较强抑菌作用的菌株进行形态特征、生理生化和分子鉴定,并克隆其抗菌蛋白基因。结果分离到1株具有较强抑制香蕉枯萎病菌能力的细菌LX1,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。抑菌实验发现LX1菌株的发酵上清液中粗蛋白有一定的抑菌作用,经过Sephacryl S-200HR柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化了其中抑菌作用最强的抗菌蛋白。质谱鉴定结果表明,抗菌蛋白与B.amyloliquefaciens FZB42内切葡聚糖酶同源性最高。根据质谱结果克隆了该抗菌蛋白的编码基因,该基因的核苷酸和氨基酸序列与B.amyloliquefaciens FZB42的内切葡聚糖酶的核苷酸和氨基酸序列同源性分别达99%和100%。拮抗香蕉枯萎病菌的芽孢杆菌LX1可作为潜在的防治香蕉枯萎病的的生防制剂,其抗菌蛋白基因也可通过遗传工程应用于香蕉枯萎病的防治。
- 卢娟夏启玉顾文亮孙建波卢雪花张欣王宇光
- 关键词：香蕉枯萎病解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白基因克隆
- 香蕉内生拮抗细菌KKWB-10的分离鉴定及其内生性证明被引量：6
- 2012年
- 从香蕉体内分离拮抗香蕉枯萎病菌的内生细菌,旨在应用于香蕉枯萎病的生物防治。从健康香蕉植株的球茎分离到多株细菌,对其进行了拮抗香蕉枯萎病菌4号小种的实验,选择其中1株拮抗性较强的菌株KKWB-10进行了形态特征、生理生化测定、16SrDNA序列分析,并通过浸根法将标记了绿色荧光蛋白GFP的该菌(K-pUCK7-1'GT菌)回接无菌的香蕉组培苗,培养10天后,制备香蕉苗的根和茎的手工切片于激光共聚焦显微镜下观察。抑菌实验结果表明,该菌株对香蕉枯萎病菌4号生理小种有较强的抑制作用。通过形态学观察、生理生化指标测定、16SrDNA序列同源性分析,将该菌株初步鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)。激光共聚焦显微镜观察发现经K-pUCK7-1'GT菌液处理的香蕉组培苗的根和茎的切片中均发现绿色荧光,而未处理的对照组的香蕉苗却没有发现绿色的荧光,表明该菌株能定殖于香蕉的根和茎内。该菌株可直接作为生防菌剂,也可用作外源抗病基因在香蕉植株体内表达的载体,在香蕉枯萎病菌的生物防治中具有一定的潜在价值。
- 王宇光顾文亮张欣卢雪花夏启玉
- 关键词：香蕉枯萎病内生细菌阴沟肠杆菌
