宋玛丽
- 作品数：5 被引量：3H指数：1
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- 重组植酸酶appAM8的异源表达与性质比较
- 2015年
- 为比较在不同宿主中表达的大肠杆菌植酸酶突变体app AM8的性质,将app AM8基因分别在大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中进行表达,对纯化后的植酸酶进行酶学性质分析与比较.结果显示:(1)在大肠杆菌中表达的app AM8(E-app AM8)和酵母中表达的app AM8(P-app AM8)的最适p H值均为4.5,最适反应温度均为65℃,与野生型的app A的最适p H无明显区别,比app A的最适温度高了5℃;(2)经SDS-PAGE检测,E-app AM8分子量(Mr)大小为47×103,而P-app AM8为53×103左右,由于在酵母中的糖基化修饰电泳显示为两条带;(3)在60-80℃之间,E-app AM8的热稳定性性明显下降,而且在70℃处理15 min后,E-app AM8残余活性仅为4%,而P-app AM8仍保留50%的残余活性,表明酵母表达的植酸酶经过糖基化修饰后提高了酶的热稳定性.(4)E-app AM8的Km=0.245 mmol/L,Vmax=3196 U/mg,P-app AM8的Km=0.36 mmol/L,Vmax=3333 U/mg.本研究表明,糖基化修饰对植酸酶app AM8的热稳定性起着重要作用,8个位点的突变对该植酸酶的稳定性也起到了一定作用.
- 宋玛丽王茜杜军惠德权梁爱华
- 关键词：糖基化热稳定性
- 多位点突变提高大肠杆菌植酸酶AppA热稳定性
- 2014年
- 为提高大肠杆菌植酸酶AppA(一种已得到广泛应用的饲料添加剂,其酶活高,pH作用范围广,但热稳定性较差)热稳定性,在appA基因上组合突变了W46E、Q62W、A73P、K75C、S146E、R159Y、N204C、Y255D、Q258N和Q349N等10个位点,突变后的基因命名为appAM10。将野生型appAppA和突变体appAM10ppAM10基因转入毕赤酵母GS115进行表达,并对重组蛋白AppA和AppAM10进行了酶学性质研究与比较。结果表明:AppAM10分子量约为55kDa,比活性为3022U/mg,AppAM10的K_m=330μmo1/L,V_(max)=3147U/mg。AppAM10的最适pH值为4.5,最适反应温度为65℃。与野生型的AppA的最适pH无明显区别,比AppA的最适温度提高了5℃。经90℃孵育15min后,AppA完全失活,而AppAM10仍残留17.5%的活性,T_m值提高约8℃,说明上述10个位点的组合突变有利于提高大肠杆菌植酸酶AppA热稳定性,其中与N-糖基化有关的N204C、Q258N和Q349N3个位点可能起着重要作用。
- 王茜姚明泽宋玛丽付月君胡风云梁爱华
- 关键词：定点突变热稳定性N-糖基化毕赤酵母
- N-糖基化对植酸酶phy(QF)酶学性质的影响被引量：1
- 2015年
- 为探讨N-糖基化对植酸酶phy(QF)酶学性质的影响,将植酸酶基因phy(QF)在毕赤酵母中进行了表达,利用脱糖基化酶Endo Hf去除重组植酸酶phy(QF)的糖链,对去除糖链前后的植酸酶phy(QF)进行了纯化和酶学性质研究与比较。结果表明,糖基化的植酸酶phy(QF)分子量约为53 k Da,酶活为3 201 U/mg,Km=392μmol/L,Vmax=3 267 U/mg;糖基化的植酸酶phy(QF)最适p H值为4.5,最适反应温度为55℃,与去糖基化的植酸酶phy(QF)的最适p H值无明显区别,比去糖基化的植酸酶phy(QF)最适温度提高了5℃,Tm值提高约2℃。经70℃孵育10 min后,去糖基化的植酸酶phy(QF)完全失活,而糖基化的植酸酶phy(QF)仍残留13%的活性,说明N-糖基化作为一种重要的翻译后修饰,对植酸酶phy(QF)的稳定性有促进作用。
- 王茜宋玛丽杜军付月君胡风云梁爱华
- 关键词：植酸酶N-糖基化圆二色谱
- 重组酸性植酸酶的异源表达和性质研究
- 植酸酶能将肌醇六磷酸（植酸）分解成为肌醇和磷酸。在食品和饲料中添加植酸酶可促进营养物质的利用，降低磷排出，对减少环境污染有重要意义。来源于大肠杆菌的植酸酶(appA植酸酶)是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶之一,然而如...
- 宋玛丽
- 关键词：植酸酶异源表达热稳定性环境污染
- 重组植酸酶appA-2QN在毕赤酵母中的高效表达被引量：2
- 2015年
- 对来源于大肠杆菌的植酸酶基因app A进行突变获得植酸酶基因突变体app A-2QN,利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后,该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量,降低植酸酶的生产成本,对表达该酶的重组酵母菌GS115/app A-2QN进行了高密度发酵研究,通过控制发酵过程中碳源(甘油)的添加使得菌体生长达到一定密度,从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段,发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量,利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明,在5 L发酵罐中进行高密度发酵147 h后,菌体浓度OD600nm达到313,通过将甲醇浓度控制在2.5%左右,经过诱导102 h后,蛋白达到了较高的表达量,为7.06 g/L,酶活性(发酵效价)为2.03×105U/m L。结果表明,通过高密度发酵提高了产植酸酶app A-2QN的酵母工程菌的细胞生长密度和蛋白质表达量,揭示该重组酵母菌株具有良好的表达稳定性。
- 宋玛丽王茜杜军赵峰梅梁爱华
- 关键词：毕赤酵母高密度发酵
