张勇侠
- 作品数：26 被引量：22H指数：4
- 供职机构：成都生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：“重大新药创制”科技重大专项国家科技重大专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 一种特异性结合CD15的全人源抗体及应用
- 本发明提供了一种全人源抗CD15抗体，其重链可变区具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列，本抗体分子与细胞粘附分子(CD15抗原)特异性地结合，其亲和力大于10<S...
- 何明跃王明蓉高强杜天飞张勇侠代云见何勇智丛聪
- 文献传递
- 诺如病毒衣壳蛋白在Tn5细胞中的表达及纯化
- 2017年
- 将人诺如病毒VA387株ORF2基因插入载体pFastBac1中,转化DH10Bac感受态细胞获得Bacmid-NoV-ORF2;脂质体介导转染sf9昆虫细胞,获得表达NoV-ORF2的重组杆状病毒Ac-NoV-ORF2.冻融破碎经Ac-NoV-ORF2感染的Tn5细胞,离心收集上清进行分子筛纯化.10%SDS-PAGE分析结果显示,重组病毒感染的Tn5细胞可见特异的蛋白条带;目的蛋白条带为相对分子质量59kD和56kD的两个条带;电镜观察发现表达的诺如病毒衣壳蛋白成功装配成了大小约为40~50nm的VLPs.结果表明在Tn5细胞中实现了诺如病毒衣壳蛋白的表达和VLPs的装配.
- 马玉晓刘兰军李玫颖张勇侠蔡峰代云见范凤鸣张雪梅赵云
- 关键词：诺如病毒病毒样颗粒
- 一种用于拯救麻疹病毒、重组麻疹病毒的系统以及方法
- 本发明公开了一种用于拯救麻疹病毒及表达GFP的重组麻疹病毒的系统、方法及用途，本发明的系统包括如下成分：1)含有麻疹病毒反基因组全长的转录质粒pT7MV<Sub>S191</Sub>或pT7MV<Sub>S191</Su...
- 刘兰军张勇侠李玫颖陈宗香
- 文献传递
- 一种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白淋巴细胞毒效价检测方法的建立被引量：1
- 2022年
- 目的建立基于人白血病T细胞株Jurkat的抗人T淋巴细胞免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte immunoglobulin,ALG)淋巴细胞毒效价定量检测方法,并进行验证。方法采用人Jurkat细胞作为靶细胞,抗人T细胞兔免疫球蛋白(商品名:Grafalon)作为待检样品,建立其淋巴细胞毒效价定量检测方法。优化反应体系,考察细胞培养密度、细胞代次对待检样品效价的影响,并对方法的精密度进行验证。结果优化的反应体系组成为50μL待检样品+50μL补体(1∶5稀释)+50μL细胞(5×10^(6)个/mL);细胞传代密度为2×10^(5)个/mL传代培养72 h或3×10^(5)个/mL传代培养48 h用于效价测定最佳;当细胞生长状态较好且一致时,从P10到P25代次的细胞效价测定结果较一致。采用该方法板内重复测定待检样品效价,变异系数(CV)为6.32%,重复性良好;不同代次Jurkat细胞测定待检样品效价6次,CV为4.15%,中间精密度良好。结论建立了一种便捷、精确的测定ALG淋巴细胞毒效价的定量检测方法,为ALG效价测定提供了一种客观、准确的评价手段。
- 杜天飞容新宗杨盛理张勇侠武志强李春阳刘兰军
- 关键词：JURKAT细胞
- Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达及其免疫血清的制备
- 2018年
- 目的原核表达、纯化II型登革病毒NS1A蛋白(NS1蛋白1～180氨基酸即DENV2 NS1A),将其免疫动物制备免疫血清并鉴定。方法构建重组融合质粒p ET22b-p64K-L-DENV2 NS1A,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG低温诱导表达。表达的融合蛋白经Hitrap Talon crude柱亲和层析纯化后,免疫雌性日本长耳兔获得抗DENV2 NS1A兔抗血清,用Western blot和免疫荧光检测免疫血清对重组麻疹病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6Xhis的识别和结合特性。结果重组融合质粒p ET22b-p64K-L-DENV2 NS1A经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组融合蛋白相对分子质量为100 000,纯化后蛋白纯度在85%以上,免疫获得的抗DENV2 NS1A兔抗血清可识别重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis表达的DENV2 NS1蛋白。结论原核表达并纯化了DENV2 NS1A蛋白,建立了基于NS1蛋白的重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis的Western blot和免疫荧光检测方法,为登革热疫苗研制中重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis的质检奠定了基础。
- 张勇侠高雅丽康庄丛聪罗心梅代云见陈宗香李立李桂华刘兰军
- 关键词：登革病毒NS1蛋白原核表达免疫荧光
- 抗IgE单链抗体在大肠杆菌中可溶性高效表达条件的研究被引量：5
- 2012年
- 目的:以抗IgE单链抗体(anti-IgE scFv)为研究对象,以大肠杆菌周质高效表达可溶性单链抗体为目标,研究不同宿主细胞、培养基及培养条件对可溶性单链抗体表达产量的影响。方法:构建Rosetta(DE3)、BL21(DE3)和SoluBL21(DE3)三种大肠杆菌工程菌,研究不同碳源、氮源、培养基配方和培养条件对可溶性抗IgE单链抗体产量的影响。结果:携带抗IgE单链抗体基因的pET-IgE26质粒在新型宿主SoluBL21(DE3)中的表达产量明显优于传统的Rosetta(DE3)和BL21(DE3)宿主菌。经碳氮源筛选、培养基和培养条件的优化,确定SoluBL21(DE3)工程菌高效表达可溶性重组抗体的最佳培养基为:以M9培养基为基础,添加0.5%葡萄糖、0.6%酪蛋白胨和0.02%微量元素。最佳的培养条件为:以LB为种子培养基,37℃过夜培养至OD600为3.0左右,以5%接种量接种于最佳发酵培养基中;接种后细胞生长条件:37℃,260r/min,培养3.5h;细胞诱导培养条件:当OD600为1.5～1.8时,降温至25℃,添加0.1mmol/L IPTG,220r/min继续培养16h。经抗原ELISA检测,抗IgE单链抗体的可溶性表达量比原始对照组提高了5倍。结论:通过对宿主细胞类型的筛选、培养基及培养条件的优化,可以显著提高重组单链抗体在大肠杆菌周质空间内的表达产量。该研究结果不仅为规模化制备抗IgE单链抗体提供了技术支持,同时为大肠杆菌生产重组小分子抗体提供了有价值的参考。
- 刘启刚代云见张勇侠王保成王明蓉
- 关键词：大肠杆菌表达条件优化
- 重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗病毒滴度荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用
- 2024年
- 目的建立检测重组麻疹病毒载体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗病毒滴度的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用。方法以重组质粒pUC57-S351为模板,扩增SARS-CoV-2 S基因,优化引物浓度,建立qPCR检测方法。对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限。应用建立的qPCR法对生物反应器连续培养感染后1~12 d的重组病毒S基因拷贝数进行检测。结果选择引物浓度为0.20μmol/L建立qPCR方法。该方法能特异性检测SARS-CoV-2 S基因拷贝数;模板浓度在2×10^(2)~2×10^(8)copies/μL之间,线性关系良好(R^(2)=0.995),检测下限为2×10^(2)copies/μL;6次重复检测重组病毒S基因拷贝数的变异系数(coefficient of variation,CV)为2.64%。应用建立的qPCR法检测生物反应器连续培养感染后1~12 d的重组病毒S基因拷贝数的结果与细胞病变法检测结果基本一致。结论建立的qPCR法专属性和重复性良好,可用于重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗病毒滴度检测。
- 杜天飞容新宗杨盛理张勇侠高雅丽武志强李春阳刘兰军
- 关键词：S基因病毒滴度
- 以麻疹病毒为载体的麻疹、风疹联合疫苗
- 本发明的目的在于，提供一种以麻疹病毒为载体的麻疹、风疹联合疫苗，属于重组载体疫苗领域。本发明首先公开了一种感染性克隆，所述感染性克隆是将风疹病毒的ORF2(包含C基因、E2基因、E1基因)片段构建到质粒载体所得到的重组质...
- 刘兰军张勇侠罗心梅高雅丽
- 腮腺炎疫苗株Jeryl Lynn 1反向遗传系统的建立
- 2019年
- 目的建立腮腺炎疫苗株Jeryl Lynn 1(JL1)反向遗传系统,获得单一成分的拯救病毒JL1R。方法将JL1全长cDNA基因序列分为7个片段(F1~F7),在F7片段的3′端引入丁型肝炎病毒核酶序列(hepatitis D virus ribozyme,HdvRZ),分段合成后分别插入载体pT7-MCS3中,根据每段重叠区域的酶切位点拼接,构建全长表达质粒pT7-MCS3-MUVJL1(HdvRz);同时构建表达腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)的3个辅助质粒;将全长表达质粒与3个辅助质粒及表达T7RNA聚合酶的质粒pCDIBP-T7RNAP共同电转染Vero细胞。对获得的病毒JL1R进行测序、病毒滴度及中和抗体测定。结果拯救病毒JL1R基因组SH及HN片段与疫苗株JL1对应片段的理论序列一致;JL1R经Vero细胞连续传代培养2~10代病毒滴度均在6 lgCCID50/mL以上;JL1R与疫苗株S79诱发抗MuV抗体滴度接近。结论成功构建了MuV疫苗株JL1的反向遗传操作系统,获得的单一成分拯救病毒JL1R可作为腮腺炎疫苗株的备选株,解决了S79疫苗生产中毒种及疫苗株的成分、纯度和批间一致性等问题,进一步提高了国内腮腺炎疫苗的免疫效果。
- 高雅丽张勇侠陈宗香康庄罗心梅丛聪李立刘兰军
- 关键词：腮腺炎病毒疫苗株反向遗传系统
- 呼吸道合胞病毒G蛋白功能的研究进展
- 2024年
- 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是全球≤5岁儿童严重下呼吸道感染的主要病原之一,在免疫功能低下人群(尤其是≥65岁老年人)中反复感染往往会导致严重疾病甚至死亡。因此,研发安全、高效的预防性药物和疫苗是预防RSV感染的重要手段。目前,大多数RSV候选疫苗和抗体的主要靶标是RSV表面的保护性抗原F蛋白的融合前构象F蛋白,而RSV G蛋白也是RSV表面的主要保护性抗原之一。G蛋白与细胞表面受体结合后促进RSV感染。在RSV感染过程中,G蛋白通过影响宿主的免疫反应引起RSV相关疾病的发生。其中,在RSV的免疫反应和致病机制中,G蛋白的CX3C趋化因子基序起重要作用。G蛋白在病毒感染过程中的机制及其特征表明,G蛋白可能是疫苗和抗病毒药物研发的重要靶点并具有巨大的研究价值。现就RSV G蛋白相关的细胞表面受体、G蛋白对RSV感染宿主的免疫反应的影响及动物研究中G蛋白致病机制的特征作一概述。
- 张勇侠周觉非(审校)
- 关键词：基序嗜酸性粒细胞增多症趋化因子受体糖胺聚糖
