朱纪法
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
- 供职机构：华中科技大学同济医学院更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 慢病毒载体表达人B型利钠肽的方法学探索
- 2005年
- 目的探索构建能表达人B型利钠肽(hBNP)的pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP载体的方法,以实现人B型利钠肽基因在骨骼肌成肌细胞中长久、稳定的表达。方法将目的基因人B型利钠肽(hBNP)亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO载体上,构建重组质粒pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP。将pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP及阳性对照质粒pLenti6/V5-D-TOPO-GFP分别用lipo-fectamin2000介导转染293FF细胞,获得病毒颗粒;用病毒颗粒转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜下计数确定阳性对照质粒的瞬时转染数,从而估计该基因的瞬时转染效率。加入筛选试剂以获得稳定表达异源B型利钠肽(BNP)的成肌细胞。收集瞬时转染及筛选后的细胞培养基,用酶连结免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒检测人B型利钠肽(hBNP)的表达水平。结果聚合酶链式反应法及DNA测序显示人B型利钠肽基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO载体中;阳性对照质粒转染细胞12h后,在荧光显微镜下观察,其转染效率达60%以上。检测收集的上清,结果与阴性对照有显著差别(P<0.01),观察至第4周,人B型利钠肽(hBNP)仍持续稳定表达。结论本实验成功构建了能在真核细胞内表达人B型钠尿肽的重组质粒pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP,并且取得了较高的转染效率,因此慢病毒载体介导的基因治疗在心血管疾病中有乐观的应用前景。
- 刘向阳卢永昕李小青刘隽李爱华罗萍朱纪法李锋
- 关键词：慢病毒载体B型利钠肽成肌细胞基因表达
