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从江香猪EDC3基因的克隆及其在不同组织中表达的分析被引量：2: 2018年; 为获得从江香猪源m RNA脱帽增强因子3 (EDC3)基因编码区序列,并分析其在从江香猪器官组织和淋巴组织中的表达情况,本研究利用套式PCR扩增获得EDC3全基因序列,对其进行测序分析;同时建立荧光定量PCR(qPCR)方法,分析EDC3在组织中的表达情况。结果显示,从江香猪源EDC3基因全长1 404 bp,编码468 aa。不同物种间EDC3基因核苷酸序列和推导氨基酸序列具有较高的保守性,该蛋白中存在丰富的磷酸化位点,空间结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。q PCR结果显示,EDC3基因在从江香猪不同器官组织及淋巴组织中均有分布且有不同程度的表达,在淋巴组织表达量最高,肺脏中表达量最低。综上,本研究首次克隆出猪源EDC3基因,且与预测野猪EDC3基因编码区序列相比缺失123 bp,在第100、473、819、1252位出现了单个碱基置换;其在不同组织中广泛分布。研究结果为进一步探究哺乳动物源EDC3的作用机制奠定基础。; 李昌红温贵兰温贵兰徐丽林汉卿徐丽杨佰启林汉卿汪德生; 关键词：从江香猪克隆

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP_2细胞株的建立及其对p65核转位影响的研究被引量：1: 2018年; 为建立一株稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(NSP_2)的细胞株,本研究通过脂质体2000介导的方法将携带有PRRSV NSP_2基因序列的真核表达载体(pcDNA3.1-5'Flag-Nsp_2)瞬时转染于HEK293细胞,应用G418筛选、间接免疫荧光(IFA)与western blot方法进行鉴定,获得了1株稳定表达NSP_2的阳性细胞株,命名为NSP_2-11C1-HEK293;将TNF-α作用于该细胞株,采用IFA分析稳转细胞内NSP_2对p65入核的影响。IFA结果显示NSP_2主要在细胞浆中围绕细胞核表达,在细胞中的表达率达95%以上;western blot结果显示出现120 ku的蛋白条带,与预期相符。结果表明本研究获得了一株稳定表达NSP_2的阳性细胞株,在该稳转细胞内NSP_2对p65的入核并没有影响,这为进一步研究揭示PRRSV的致病机理奠定基础。; 温贵兰张升波李昌红徐丽; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒

副鸡嗜血杆菌贵州株的分离鉴定被引量：1: 2018年; 为查明贵州省某规模化养鸡场患病鸡的病原,从患病鸡内脏及眶下窦处采集病料,分离到1株细菌,对其进行革兰染色镜检、生化试验及16SrRNA序列比对。序列比对表明,该分离株16SrRNA与GenBank中各亚型副鸡嗜血杆菌株16SrRNA的核苷酸同源性在93.6%～99.4%之间,证实其为副鸡嗜血杆菌,将其命名为HPG-GZ-2017。遗传进化树分析表明,HPG-GZ-2017与C型标准菌株CAPM 5111(GenBank:M75056)处于同一小分支,亲缘关系较近,核苷酸同源性也较高。动物感染试验表明其致病性较低。药敏试验表明,HPG-GZ-2017对头孢克洛高敏,对红霉素中敏,对四环素、环丙沙星、卡那霉素、青霉素、诺氟沙星、头孢拉定低敏,对复方新诺明、链霉素耐药。研究结果可为副鸡嗜血杆菌病的防治提供依据。; 林汉卿温贵兰温贵兰汪德生徐丽徐丽李昌红文明周碧君; 关键词：副鸡嗜血杆菌

雏鸡关节炎型沙门氏菌GZ2018株的分离鉴定: 2019年; 为雏鸡关节炎的防治提供参考,对贵州某肉鸡养殖场患病鸡进行病理解剖、分离培养、染色镜检、生化试验和16SrRNA基因序列分析等病原分离鉴定。结果表明:分离菌的培养特性、菌落形态特征、生理生化特征均与肠炎型沙门氏菌相同,并命名为GZ2018;分离菌对红霉素、头孢曲松、环丙沙星、丁胺卡那、氯霉素、庆大霉素和多黏霉素高度敏感;16SrRNA基因序列与肠炎型沙门氏菌的同源性在94.6%～100%;分离菌的遗传进化树与沙门氏菌属在同一分支,与中国分离株CQ0709(GenBank:FJ465088.1)在同一小分支上,属于鸡沙门氏菌。; 杨佰启温贵兰陈彦希陈彦希张升波徐丽李昌红徐丽文明李昌红张军; 关键词：鸡沙门氏菌关节炎 RRNA基因

Marc145细胞源DCP2基因克隆及其X1亚型蛋白高免血清制备: 2020年; 为分析DCP2基因的特点,研究其编码蛋白的生物学功能及其在病毒复制中的作用机制。本试验拟获取Marc145细胞源DCP2基因序列,构建其原核表达质粒,获得重组蛋白,制备高免血清。结果显示,成功获得了DCP2基因的两种转录变异体编码区,即长度为1263 bp的X1亚型和1158 bp的X2亚型,X1亚型基因序列与X2亚型相比,除了第576位碱基A变成G,第613位碱基C变成T,第945~1049位多出105 bp碱基外,其他地方完全一致。DCP2X1亚型基因编码氨基酸序列与X2亚型相比,除945~1049位多出的105 bp基因造成的第314~349个氨基酸的位置多出36个氨基酸外,其余完全一致,第576位、第613位碱基的不同并没有造成氨基酸的变化。DCP2 X1亚型蛋白二级结构与X2相比,除了多出的36个氨基酸不同外,其余地方也不一样。构建的携带DCP2 X1亚型基因的原核表达质粒,诱导表达的蛋白为不可溶性蛋白,纯化后免疫兔子,成功获得了针对DCP2 X1亚型原核表达蛋白的兔源高免血清,效价为1∶6400。本试验成功获得了DCP2基因X1、X2亚型编码区序列,并大量制得X1亚型重组原核表达蛋白及其高免血清,为进一步研究DCP2的生物学功能及其在病毒复制中的作用机制提供了必要材料。; 陈绍品温贵兰林汉卿张升波李昌红徐丽龚新勇汪德生文明周碧君程振涛; 关键词：高免血清原核表达

禽白血病病毒贵州流行株gp85基因的序列分析被引量：4: 2017年; 为了解禽白血病病毒(ALV)gp85基因的特点,采用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物,对gp85基因进行扩增、克隆及序列测定,用相关生物学软件对贵州流行株gp85基因进行序列分析,并对其编码蛋白进行二级结构、B细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽预测。测序获得921 bp长的序列,将此流行株命名为ALV-GZ-16。分析发现,流行株ALV-GZ-16的gp85基因核苷酸序列与J亚群中国分离毒株的gp85基因序列同源性为97.5%~99.9%,其编码的氨基酸序列与J亚群中国分离毒株的同源性为96.8%~99.7%;系统进化分析显示,该流行株与J亚群原型毒株处于同一分支,与贵州分离株GZN49处于同一小分支;其二级结构中无规则卷曲和β-折叠所占比例较大;预测此蛋白存在4个B细胞优势抗原表位,无跨膜结构和信号肽区域。研究结果进一步完善了贵州省禽白血病病毒流行株的生物学特性,为gp85蛋白特异性抗体的制备提供一定的理论基础。; 林汉卿陈绍品温贵兰汪德生张升波徐丽李昌红龚新勇文明周碧君程振涛; 关键词：禽白血病病毒 GP85基因

从江香猪源Ⅰ、Ⅱ型干扰素生菜中融合表达及其生物活性: 2019年; 干扰素(interfern,IFN)是在特定的诱生剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,具有广谱抗病毒活性。从江香猪源Ι型干扰素α2和Ⅱ型干扰素γ于生菜中融合表达及生物活性研究未见报道。本研究应用生菜植物表达系统,将从江香猪源干扰素植物表达载体PBI121-IFNα2、PBI121-IFNα2γ、PBI121-IFNγ、PBI121-Vec转入根癌农杆菌LBA4404中,用真空渗透法将携带干扰素质粒的根癌农杆菌感染生菜叶片;用β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)染色和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-PCR)技术分析从江香猪源干扰素蛋白活性。结果显示:GUS染色和ELISA检测证明从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中实现了表达;Q-PCR检测显示:在Marc-145细胞上从江香猪源干扰素蛋白对PRRSV的复制有明显抑制作用,在PK15细胞上从江香猪源干扰素蛋白对干扰素γ诱导蛋白30(interferon-gamma-inducible protein 30,IFI30)、2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′oligoadenylate synthetase,OAS)、抗黏液病毒蛋白(myxovirus resistance,MX)基因的mRNA水平的上调有一定的促进作用。本研究成功实现从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中进行表达且表达蛋白具有生物学活性,为从江香猪源Ι型和Ⅱ型干扰素新复合型药物植物蛋白的开发利用提供参考依据。; 田浪温贵兰张升波杨佰启李昌红李昌红张喜懿; 关键词：生菜生物活性

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2分段真核表达及其细胞定位分析: 2019年; 为探讨非结构蛋白2(non-structural protein 2,NSP2)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)复制过程中的作用及机制,本研究构建真核重组质粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323,并瞬时转染至HEK 293T中,同时设置完整NSP2基因序列重组质粒作为对照,转染48 h后分别用不同的抗体进行间接免疫荧光监测。结果显示,转染对照组中细胞核周围可见特异性荧光,而转染真核重组质粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323后,不仅在细胞核周围,在细胞核内也可以观察到特异性荧光。本研究成功构建真核重组质粒pcDNA 3.1-5'Flag-NSP2-147-323,并可在HEK 293T细胞中正确表达,为进一步研究NSP2在PRRSV复制过程中的作用提供依据和基础。; 徐丽温贵兰温贵兰张升波李昌红林汉卿李昌红田浪; 关键词：转染

从江香猪源干扰素γ植物表达载体构建及在生菜中瞬时表达: 2019年; 为构建从江香猪源干扰素γ(IFNγ)植物表达载体,通过农杆菌真空渗透法在新鲜生菜中实现瞬时表达。参考GenBank登录的猪IFNγ基因序列设计1对特异性IFNγ引物,采用RT-PCR方法从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ基因序列,将其克隆至植物表达载体PBI121,转化根癌农杆菌LBA4404,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定;携带重组质粒根癌农杆菌真空渗透法感染生菜,GUS染色检测感染的生菜叶片,ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白,分析重组质粒在生菜中表达效果;采用细胞病变抑制实验检测生菜中从江香猪源IFNγ蛋白抗病毒活性。结果表明:本研究成功地从贵州从江香猪源肝脏组织扩增获得IFNγ基因序列并构建了从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ;GUS染色感染的生菜叶片可见蓝色物质;ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白含量为169.397、170.657、170.37 pg/mL;生菜中表达从江香猪源IFNγ经4^-6稀释在Marc145细胞上仍能够抑制100 TCID50的PRRSV的致细胞病变作用。本实验成功构建从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ,生菜中瞬时表达蛋白具有免疫反应性和抗病毒活性,为从江香猪源IFNγ药用植物蛋白的研究开发提供参考依据。; 田浪温贵兰张升波杨佰启李昌红李昌红陈广徐丽; 关键词：植物表达载体生菜抗病毒活性

贵州某鸡场一株卡氏杆菌的分离与16S rDNA基因的分析鉴定: 引言禽卡氏杆菌病是由卡氏杆菌引起的危害蛋鸡鸡群重要的传染病之一,临床上常以输卵管囊肿和卵巢炎等为主要特征。1950年,Hansen首次发现卡氏杆菌,1960年被定为溶血性巴氏杆菌,Christensen等2003年以该细...; 张升波温贵兰陈绍品管国丹林汉卿李昌红徐丽; 文献传递

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