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自噬基因Beclin1启动子细胞自噬模型的建立被引量：6: 2015年; 【目的】构建自噬基因Beclin1启动子报告基因细胞自噬模型,为筛选出以Beclin1为靶标的中药提供新的细胞模型。【方法】采用瞬时转染双荧光素酶报告基因测定法,确定最佳转染浓度、时间等条件,及Beclin1基因启动子转录活性细胞自噬模型的建立和验证,观察血清饥饿、过氧化氢氧化损伤及自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素对Beclin1基因启动子转录活性PC12细胞自噬模型的影响。【结果】血清饥饿诱导12 h,Beclin1基因启动子转录活性是体积分数10%血清组的1.8倍,而血清饥饿诱导18、24 h与诱导12 h比较其转录活性无明显变化;300μmol/L过氧化氢诱导9 h,Beclin1基因启动子转录活性是0μmol/L过氧化氢组的1.3倍;雷帕霉素在浓度0.1、1 nmol/L可上调Beclin1基因启动子转录活性,并呈浓度依赖性,而5 nmol/L及更高浓度的雷帕霉素可下调Beclin1基因启动子转录活性。【结论】成功建立用Beclin1基因启动子报告基因检测Beclin1基因启动子转录活性特异性的细胞发生自噬模型,血清饥饿、过氧化氢、自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素可诱导Beclin1基因启动子的转录活性。; 黄凤媛李菲曾飞剑李昀骏侯秋科黄俊铭胡跃强陈东风黎辉李伊为邓汝东周健洪魏刚黄贵华; 关键词：转录活性细胞模型血清饥饿自噬

小鼠高迁移率族蛋白B1启动子的构建与转录活性检测: 2014年; 【目的】构建小鼠高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子全长序列的荧光素酶报告基因用于药物筛选。【方法】采用PCR技术扩增小鼠HMGB1基因启动子全长序列,用GV238载体构建报告质粒GV238-HMGB1-P-Luc,以pGL3-basic作为阴性对照质粒,与内参质粒pRL共转染Hela细胞,以内毒素(LPS,0.2μg/mL)作为激活剂,以正丁酸钠(SB,10 mmol/L)作为抑制剂,分组处理24 h后检测荧光素酶活性。【结果】经酶切、PCR及测序鉴定证实克隆的HMGB1基因启动子全长2 140 bp,DNA序列正确无突变。与pGL3-basic组比较,GV238-HMGB1-P-Luc组荧光素酶活性显著增强(P<0.05);与GV238-HMGB1-P-Luc组比较,LPS组荧光素酶活性显著增强(P<0.01);与LPS组比较,SB组荧光素酶活性显著降低(P<0.01)。【结论】HMGB1基因启动子报告基因构建成功,LPS可以增强其表达,SB则可以抑制LPS刺激下的HMGB1启动子表达增强,可为下一步筛选具有调控HMGB1启动子活性的药物奠定基础。; 温泉杜少辉田瑞敏黎晖白晔李菲雷航陈东风李伊为周健洪张赛霞邓汝东余曜; 关键词：高迁移率族蛋白B1 启动子荧光素酶报告基因

蠲脉Ⅰ号化痰消食拆方促进蛋白激酶B表达抑制内皮细胞自噬性死亡被引量：5: 2014年; 【目的】探讨蠲脉Ⅰ号化痰消食拆方(简称化痰消食方)对自噬损伤内皮细胞保护作用的物质基础,以及对蛋白激酶B(PKB)和自噬相关的微管相关蛋白LC3、泛素结合蛋白P62表达的影响。【方法】采用递增极性溶剂法分别分离提取化痰消食方(成分为半夏、茯苓、枳实、白术、山楂、神曲)的石油醚、乙酸乙酯、乙醇以及水部位。将4个部位的提取物分别作用于过氧化氢诱导的自噬性损伤内皮细胞,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察内皮细胞的活性,采用GC-MS(gas chromatography-mass spectrometry)分析有效部位的化学成分,并采用Western blot法观察有效部位对PKB表达及自噬的影响。【结果】石油醚部位为化痰消食方保护内皮细胞自噬性损伤的活性部位;GS-MS检测发现石油醚部位主要成分为多种脂肪酸;Western blot分析结果显示:石油醚部位能上调PKB表达、下调LC3表达,抑制LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化,并使细胞内P62表达水平升高。【结论】石油醚部位多种脂肪酸为化痰消食方有效部位,能促进细胞内PKB表达,抑制细胞内的自噬水平,从而拮抗内皮细胞的自噬性死亡。; 白晔李菲黄凤媛邓柏杨李熙灿陈东风黎晖邓汝东周健洪; 关键词：内皮细胞自噬细胞培养

温阳活血方有效部位促进分化抑制因子1表达及抑制内皮细胞自噬性死亡的研究被引量：8: 2014年; 目的探讨温阳活血方对自噬损伤内皮细胞保护作用的物质基础以及对凋亡相关因子Activate Caspase-3、自噬相关蛋白泛素结合蛋白P62以及分化抑制因子1(ID1)表达的影响。方法将温阳活血方不同极性提取物(石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物和水提取物)作用于过氧化氢诱导的自噬性损伤内皮细胞模型,应用二苯基四氮唑溴盐(MTT)法观察内皮细胞的活性,用气相色谱-质谱联用技术(GS-MS)分析有效部位的化学成分,Western blot法检测有效部位对Activate Caspase-3、P62、ID1表达的影响。结果温阳活血方石油醚部位可提高内皮细胞活性;GS-MS检测发现石油醚部位主要成分有4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丁酮、3-丁烯基苯酞、Z-藁本内酯、E-藁本内酯、2,10-冰片二醇、Z,Z-9,12-亚油酸、6-姜酚、8-姜酚等;Western blot检测发现,石油醚部位能上调ID1、P62的表达,抑制Activate Caspase-3的表达。结论石油醚部位是温阳活血方对抗内皮细胞自噬性死亡的活性部位,其通过降低内皮细胞内Activate Caspase-3的表达,提高P62和ID1的表达,以对抗内皮细胞的自噬性死亡。; 白晔李菲黄凤媛邓柏杨李熙灿陈东风黎晖邓汝东周健洪; 关键词：温阳活血方内皮细胞氧化应激自噬

p53基因启动子转录活性检测细胞模型的建立被引量：2: 2013年; 【目的】构建p53基因启动子靶控报告基因细胞模型,为高通量筛选出以p53为靶标的中药提供新的细胞模型。【方法】采用瞬时转染报告基因测定法,确定最佳转染方案及p53基因启动子转录活性细胞模型的建立和验证,观察p53抑制剂PFT-a、血清饥饿、过氧化氢、自噬激活剂雷帕霉素对p53基因启动子转录活性PC12细胞模型的量效和时效关系。【结果】PFT-α诱导3 h,对p53基因启动子转录活性抑制率达50%左右;血清饥饿诱导12、24、36 h,p53基因启动子转录活性是对照组的1.6倍;过氧化氢300μmol/L诱导9 h,p53基因启动子转录活性是对照组的1.3倍;雷帕霉素在浓度为0.1、1 nmol/L可上调p53基因启动子转录活性,呈浓度依赖性,而5 nmol/L及更高浓度可下调p53基因启动子转录活性。【结论】成功建立采用p53基因启动子报告基因检测p53基因启动子转录活性的特异性细胞模型,血清饥饿、过氧化氢、雷帕霉素可诱导p53基因启动子的转录活性。; 秦红芳曾玲陈静白晔李菲黄开远温泉赖宝玲陈东风黎晖邓汝东周健洪魏刚刘东辉赖英桃李伊为; 关键词：转录活性细胞模型血清饥饿

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李菲