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荧光定量PCR检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组DNA的残留量被引量：5: 2014年; 目的：建立real—timePCR定量检测毕赤酵母基因组DNA残留量的方法，提高重组新蛭素的产品安全性。方法：选择拷贝数高且分布广泛的毕赤酵母5SrRNA基因为靶标基因设计扩增引物，提取酵母基因组DNA，稀释后作为扩增模板。以罗氏荧光定量PCR_Light Cycler 480平台为基础，建立基于SYBR Green Ⅰ荧光染料的real—timePCR的检测方法，并考察用该方法检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组残留量的灵敏度、精密度和回收率。结果：该法检测宿主DNA残留量灵敏度高，DNA浓度为0．1～1000pg／μL范围内呈现良好的线性关系，其标准曲线的误差值小于0．2；用该法对5批注射用重组新蛭素（酵母）产品中宿主基因组DNA残留量进行了测定，结果分别为0．03、2.3、0.2、0．6、0．2μg／mg。结论：该方法具有操作简便、灵敏度高等优点，可用于重组产品中酵母基因组残留DNA的定量测定。; 刘晶晶郭莹莹李艳琪王文文吴祖泽靳继德; 关键词：荧光定量PCR 毕赤酵母

胎盘源间充质干细胞分离提取的新方法被引量：5: 2015年; 背景:胎盘是获取间充质干细胞的理想来源,在干细胞治疗和再生医学中具有潜在广泛的用途,建立高效分离提取方法有助于其存储和临床应用。目的:分析组织绞碎加酶液消化法培养人胎盘间充质干细胞的生物学特性。方法:采用组织绞碎加酶液消化法分离、富集胎盘组织中间充质干细胞,应用流式细胞术检测细胞表面标记,MTT法分析增殖能力,并采用诱导剂定向诱导胎盘间充质干细胞成脂、成骨和成软骨分化。结果与结论:胎盘组织来源间充质干细胞在体外可稳定长期传代培养,应用流式细胞仪检测结果显示CD73、CD90、CD105表达阳性,CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表达阴性。胎盘间充质干细胞增殖活跃,第3-5天进入对数生长期,第6天进入平台期。经诱导后,胎盘间充质干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化的潜能。结果表明联合利用组织绞碎和酶液消化法可高效获取胎盘间充质干细胞,在体外培养过程中生长稳定,增殖能力强,可长期传代。; 刘洋李艳琪王洪一吴晓冰荆永光徐潇姚尧张宇吴祖泽靳继德; 关键词：间质干细胞细胞培养技术干细胞胎盘间充质干细胞酶消化细胞培养

人脐带源和胎盘源间充质干细胞的生物学特性比较被引量：3: 2015年; 目的探讨人脐带和胎盘来源间充质干细胞(MSCs)的分离培养和生物学性状的差异,为MSCs的临床应用提供选择依据。方法利用组织贴壁法分离培养脐带MSCs,酶消化法分离培养胎盘MSCs。传代培养后于倒置显微镜下观察两种不同来源的MSCs的细胞形态,流式细胞仪检测两者表面标志物表达的差异,通过细胞周期和群体倍增时间测定比较两者生长增殖能力,体外成骨和成脂诱导比较其分化能力。结果胎盘MSCs和脐带MSCs为贴壁生长、形态均一的成纤维样或长梭形外观,两种细胞均高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。胎盘MSCs的群体倍增时间为40.8 h,52.12%处于G0/G1期,脐带MSCs的群体倍增时间为39.5 h,57.50%处于G0/G1期,表明两者增殖能力旺盛,且无明显差异;两者在体外均可诱导分化成骨细胞和脂肪细胞。结论胎盘源MSCs具有与脐带源MSCs相似的生物学特性,两者均可作为临床治疗用细胞或组织工程的种子细胞。; 李艳琪王洪一姚尧张宇刘洋吴祖泽靳继德; 关键词：人胎盘间充质干细胞人脐带间充质干细胞生物学特性生物学标记

人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进被引量：9: 2014年; 背景:脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能,以及取材方便等优点而日益受到关注。目的:建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法,并对其生物学特性进行分析。方法:无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带,利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞,即将传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养,取第3代脐带间充质干细胞进行生物学特性分析。结果与结论:组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出,第10天左右可形成明显的细胞克隆。将组织块转移到新培养瓶中继续培养,2 d后即可见有细胞爬出,细胞生长速度较快,5 d即可形成细胞克隆。传代后的细胞形态均一,呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。细胞增殖能力旺盛,平均倍增时间为50 h左右,41.24%的细胞处于G2/S期。体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性,而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。; 李艳琪王洪一姚尧刘晶晶徐潇张宇刘洋吴祖泽靳继德; 关键词：干细胞脐带间充质干细胞

肝细胞生长因子基因修饰的人脐带间充质干细胞对大鼠慢性肝损伤的治疗研究被引量：3: 2013年; 目的:研究肝细胞生长因子(HGF)基因修饰的人脐带间充质干细胞(MSC)对Wistar大鼠慢性肝损伤的治疗作用。方法:利用携带人HGF基因的重组腺病毒(Ad-HGF)对MSC进行基因修饰;通过皮下注射CCl4-橄榄油溶液建立大鼠肝损伤模型;56只Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、MSC组、HGF组和HGF/MSC组,分别尾静脉注射生理盐水、MSC、Ad-HGF或HGF/MSC,通过血清肝功能检测及肝组织的生化指标、病理切片等评价治疗效果。结果:利用腺病毒将HGF基因转入MSC并确定了最佳感染条件。CCl4-橄榄油诱导4周后,动物肝脏外观出现明显的脂肪变性和血清转氨酶明显升高,表明成功诱导了大鼠慢性肝损伤模型。经过4周治疗,治疗组动物的体重明显升高、肝指数明显降低,动物存活率高于模型组(模型组:50%;MSC组:70%;Ad-HGF组:70%;HGF/MSC组:90%)。肝功能指标测定结果显示,与模型组比较,HGF/MSC组动物的天门冬氨酸氨基转移酶(406.75±35.98 vs.513.75±12.71U/L,P<0.01)、丙氨酸氨基转移酶(124.6±10.6 vs.169.67±15.38 U/L,P<0.05)和总胆红素(14.6±2.08 vs.19.25±1.38g/dL,P<0.01)均明显降低,白蛋白含量(29.1±1.3 vs.22.05±2.61 g/L,P<0.05)明显升高;Ad-HGF组只有天门冬氨酸氨基转移酶(436.0±18.40 vs.513.75±12.71 U/L,P<0.05)明显降低;而单纯MSC治疗对肝功能改善不明显。丙二醛测定结果显示,治疗后动物肝组织中的过氧化反应均较模型组显著减弱。HGF/MSC组和MSC组动物肝组织中的羟脯氨酸含量与模型组比较明显降低(69.27±14.58,63.23±13.23 vs.96.59±15.05 mg/mL,P<0.01)。上述实验结果提示3种治疗方式对CCl4-橄榄油引起的大鼠肝损伤均有一定的治疗效果,可减轻CCl4导致的肝损伤程度,增加动物体重,降低肝脏指数,减轻肝组织的过氧化反应,提高动物的存活率,其中HGF/MSC治疗效果最为明显,而且细胞注射没有引起动物的不良反应。结论:3种治疗方式均可改善CCl4导�; 陈瑶瑶李艳琪刘杨汪劲松刘冬梅吴祖泽靳继德; 关键词：肝细胞生长因子间充质干细胞 CCL4 慢性肝损伤

重组低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵工艺研究及其纯化与鉴定被引量：5: 2013年; 目的：通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进，建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白（EH）的中试发酵工艺，为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法：首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线，然后根据生长曲线，将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后，直接接种到500L的发酵罐中放大培养，通过发酵液的D_600nm值、溶氧值（D02）及菌体湿重动态监测细菌的生长状态，并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白；表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白；用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度；用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量；用Western印迹验证目的蛋白；用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果：发酵结束时，上清中蛋白含量达1．41g／L，经后期分离纯化，得到约21gEH蛋白，SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13．2×10^3±0．2×10^3，质谱分析相对分子质量约为7.3×10^3±0．73×10^3；Western印迹表明检测条带为目的蛋白，能被抗水蛭素抗体特异性结合；非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95％；凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512～1024ATU／mg。结论：建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。; 郝木强李彦英刘春杰王秀冬刘晶晶李艳琪刘洋刘洋吴祖泽; 关键词：水蛭素重组蛋白毕赤酵母中试放大

过氧化氢诱导间充质干细胞衰老模型的建立被引量：8: 2015年; 目的建立间充质干细胞(MSCs)衰老模型,探讨其衰老的相关生物学改变,从而为衰老相关研究提供有效的细胞模型工具。方法取新生胎盘组织利用酶消化法分离纯化获得人胎盘源间充质干细胞(MSCs)。将第3代细胞接种到培养皿。在完全培养基基础上分别加入终浓度100、200、300μmol/L的过氧化氢(H2O2)培养2 h,处理结束后更换为完全培养基继续培养24 h。进行MTT、细胞周期分析、分化诱导实验和β-半乳糖苷酶染色验证衰老MSCs模型的建立,应用RT-PCR法检测衰老相关基因p16、p21、p53 mRNA的表达变化。结果与对照组比较,200μmol/L H2O2作用2 h,倒置显微镜下见MSCs形态较为宽大扁平;MTT光密度值显著下降,流式检测结果显示细胞周期处于G0/G1期细胞比例增加;成脂、成骨和成软骨分化能力减弱;β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比显著升高;p16、p21、p53 mRNA表达水平显著升高。结论 200μmol/L H2O2作用2 h可建立MSCs体外衰老模型,该模型细胞的生物学变化可能是由p16、p21、p53细胞周期蛋白的活性调节引起的。; 刘洋刘洋吴晓冰荆永光李艳琪王洪一徐潇吴祖泽; 关键词：胎盘衰老 H2 O2

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李艳琪

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