营孙阳
- 作品数：6 被引量：17H指数：1
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市科技新星计划北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人TR基因真核表达载体的构建
- 2016年
- 目的构建人端粒酶RNA组分(h TR)的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法以人胚肾293T细胞RNA逆转录得到的c DNA为模板,采用PCR技术扩增出h TR编码序列,将其插入到p CDNA 3.0载体中;将重组质粒与空载体分别转染293T细胞,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测其表达情况,在Hep G2细胞中构建此基因的稳定细胞系并用qRT-PCR检测其效果,通过RNA结合免疫共沉淀(RIP)实验验证其和人端粒酶逆转录酶(h TERT)及角化不良蛋白(dyskerin)的相互作用,通过端粒酶重复序列扩增技术(telomerase repeat amplification protocol,TRAP)检测过表达h TR后Hep G2细胞的端粒酶活性。结果双酶切和测序结果表明,p CDNA3.0-h TR的真核表达载体构建成功;转染293T细胞用qRT-PCR证明成功表达;qRT-PCR证实Hep G2 p CDNA3.0-h TR稳定细胞系筛选成功;RIP实验证实了h TR与h TERT和角化不良蛋白之间存在相互作用;TRAP实验发现过表达h TR并不影响Hep G2细胞的端粒酶活性。结论成功构建了p CDNA 3.0-h TR真核表达载体,为进一步研究以针对h TR为靶标的癌症治疗奠定了基础。
- 营孙阳熊加秀麦洪旭林佳佳姜丽娜程龙叶棋浓
- 关键词：端粒酶HTR基因克隆真核表达
- E6AP蛋白结构域突变真核表达载体的构建及其生物学功能检测
- 2016年
- 目的构建E6AP蛋白结构域突变真核表达载体,并瞬时转染肿瘤细胞,对其生物学功能进行初步检测。方法以本实验室保存带有myc标签的E6AP质粒为模板,采用PCR技术扩增出E6AP（1～494）结构域和E6AP（495～852）结构域（即E6AP的HECT结构域）编码区（CDS）序列,将其插入到p XJ-40-myc载体中,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹鉴定其表达及功能;转染人乳腺癌细胞ZR75-1和人胃癌细胞BGC-823,通过CCK-8法测定细胞生长曲线。结果从E6AP蛋白全长CDS中扩增得到约1479、1071 bp的DNA结构域片段,并成功克隆至p XJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,目的蛋白在细胞内成功表达,并且E6AP（495～852）结构域可明显抑制P53蛋白水平,而E6AP（1～494）结构域无抑制作用;细胞生长曲线结果显示,转染E6AP（495～852）结构域突变质粒的乳腺癌、胃癌细胞较空载体细胞生长差异具有统计学意义,而E6AP（1～494）对细胞生长无明显变化。结论成功构建了myc-E6AP（1～494）、（495～852）结构域突变真核表达载体,为进一步研究E6AP蛋白在相关肿瘤发生、发展中的作用奠定一定的基础。
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- 关键词：P53泛素化肿瘤
- Akt1原核表达载体GST-Akt1的构建及鉴定
- 2016年
- 目的:构建带GST标签的Akt1原核表达载体,获得GST-Akt1原核表达蛋白,并进行体外激酶实验验证其能否发生磷酸化修饰。方法:以乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增出Akt1编码序列,将其插入p GEX-KG载体,鉴定正确后转化大肠杆菌Rossate诱导表达,纯化蛋白后进行体外激酶实验,检测得到的蛋白是否可以发生磷酸化修饰。结果:双酶切和测序结果表明GST-Akt1原核表达质粒构建成功,考马斯亮蓝染色结果表明GST-Akt1蛋白获得表达,体外激酶实验表明GST-Akt1蛋白可发生磷酸化修饰。结论:构建了带GST标签的Akt1原核表达载体,为进一步研究Akt1磷酸化发生和调节的机制奠定了基础。
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- 关键词：AKT1克隆原核表达
- 多西他赛诱导乳腺癌MCF-7耐药细胞株的建立及耐药机制分析被引量：1
- 2016年
- 目的:建立人乳腺癌MCF-7多西他赛(DTX)耐药细胞株,并对其耐药机制进行初步分析。方法:采用逐步提高多西他赛浓度、间歇诱导的方法,建立人乳腺癌MCF-7/DTX体外耐药细胞模型;耐药曲线检测MCF-7/DTX的耐药特性;流式细胞术比较耐药细胞株MCF-7/DTX及亲本细胞株MCF-7肿瘤干细胞含量的差异。结果:耐药曲线显示MCF-7/DTX比亲本细胞株MCF-7耐药;流式细胞分析显示MCF-7/DTX的细胞干细胞含量为2.59%,MCF-7细胞的干细胞含量为1.28%。结论:采用逐步提高浓度、间歇诱导的方法,建立了稳定、耐药性较高的MCF-7/DTX细胞株;干细胞含量升高是MCF-7/DTX的可能耐药机制之一。
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- 关键词：多西他赛乳腺癌耐药干细胞
- 端粒酶调控研究进展被引量：16
- 2016年
- 端粒酶主要包括催化组分端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)和端粒酶RNA组分(Telomerase RNA component,TERC),二者与其他端粒酶复合体亚基共同组装成具有延伸端粒末端功能的全酶,在细胞衰老和肿瘤发生过程中发挥关键的作用。端粒酶调控的分子机制复杂,调控过程包括组装前各组分的转录调节、转录后调控、翻译后修饰以及亚细胞定位的调控,还包括组装过程中各组分的运输和装配的调控,以及组装后募集到端粒末端的调控。本文从以上几个方面对端粒酶的调控机制进行了综述,旨在为端粒酶相关领域的研究以及开发以端粒酶为靶点的药物奠定理论基础。
- 营孙阳熊加秀麦洪旭林佳佳姜丽娜程龙叶棋浓
- 关键词：端粒酶端粒
- 敲低PES1基因抑制舌癌细胞的生长
- 2015年
- 目的构建稳定表达PES1 shRNA的舌癌细胞系,研究敲低PES1基因对舌癌细胞生长的影响。方法在293T细胞中包装并获得敲低PES1基因的病毒,然后将病毒感染Tca8113、SCC6和SCC15 3种舌癌细胞并筛选稳定克隆,Western印迹检测PES1蛋白的表达水平;利用生长曲线检测敲低PES1对舌癌细胞生长的影响,流式细胞术检测敲低PES1对舌癌细胞周期的影响。结果成功构建稳定表达PES1 shRNA的舌癌细胞系,敲低PES1基因能够抑制舌癌细胞的生长,使细胞周期阻滞在G0/G1期,敲低PES1抑制cyclin D1的表达。结论敲低PES1抑制舌癌细胞的生长,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制cyclin D1的表达,因此PES1可能成为舌癌基因治疗的靶标。
- 任伟程龙杜佩云姜丽娜营孙阳林佳佳张菊会叶棋浓王恩群
- 关键词：舌肿瘤细胞生长细胞周期细胞周期蛋白D1
