张春彦
- 作品数：26 被引量：44H指数：4
- 供职机构：首都医科大学附属北京胸科医院更多>>
- 发文基金：北京市优秀人才培养基金北京市科技新星计划教育部留学回国人员科研启动基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较
- 2003年
- 目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53C—DNA真核细胞表达载体pEGFP—p53(RS)，pEGFP—p53(AS)，载体有绿荧光蛋白基因监测基因转染和表达。经酶切图证明p53正向或反向联结。Liipofectin介导转染801D细胞(801D细胞有p53缺失和突变，蛋白表达阳性)，G418筛选，建立单克隆细胞系。PCR检测外源p53和neo基因。荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白表达。免疫组化染色证明突变蛋白表达。比较了pEGFP—p53(AS)和pEGFP—p53(RS)集落形成试验，裸鼠移植试验。FCM分析细胞周期。结果 酶切图证明pEGFP—p53(RS)和pEGFP—p53(AS)的p53c—DNA(RS)分别正向和反向联结质粒pEGFP。Lipofectin介导转染细胞801D细胞，G418筛选，获耐受集落，建立单细胞克隆转染细胞系pEGFP—p53(RS)—801D，pEGFP—p53(AS)801D和pEGFP—801D。PCR检测外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，证明外源基因存在并稳定表达。免疫组化检测pEGFP—p53(AS)—801D，突变蛋白呈阴性，母系为阳性，显示反义p53封闭突变蛋白表达。pEGFP—p53(RS)—801D和pEGFP—p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤率均降低，pEGFP—p53(RS)-801D更低。FCM分析细胞周期延滞。结论 有p53缺失和突变的人肺癌细胞系801D体内外恶性增殖明显，在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可重建抑癌功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。
- 汪惠赖百塘李金照扬学惠张春彦岳文涛张洪涛李曦湛秀萍王玥
- 关键词：基因突变人肺癌裸鼠细胞恶性表型
- RNA干扰环氧化酶-2基因表达对A549细胞体外恶性增殖的影响
- 2008年
- 目的研究不同靶点对环氧化酶-2（COX-2）基因表达的抑制及其对A549细胞体外恶性增殖的影响。方法以COX-2第3、7和10外显子为靶点，构建3个带有人U6启动子的COX-2小干扰RNA（siRNA）表达载体。用脂质体lipofectamine介导，分别将3个siRNA表达载体及2个空载体转染到cox-2表达阳性的A549细胞，建立转染细胞株。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot方法检测COX-2表达水平的变化。通过细胞生长曲线、集落形成试验研究COX-2不同干扰靶点对A549细胞体外增殖的影响。结果3个siRNA和u6启动子序列正确并准确克隆到pEGFP载体。转染细胞株分别命名为A549—3，A549—7、A549—10、A549-p和A549-pU6。转染后24、48、72h，A549-p细胞均有绿色荧光表达，而A549-pU6、A549-3、A549—7和A549—10细胞均未观察到绿色荧光。RT—PCR和Western blot结果显示，以COX-2第3、7和10外显子作为靶点进行干扰，COX-2表达均受到抑制。与A549细胞比较，A549—3、A549-7、A549-10细胞的COX-2 mRNA表达量分别降低10．6％、33．4％和61．2％，COX-2蛋白表达量分别降低26．7％、44．7％和56．2％。细胞生长曲线、集落形成试验的结果显示，A549—10细胞生长减慢，集落形成率减少，而3外显子和7外显子两个干扰靶点对A549细胞生长没有明显的影响。结论以COX-2第10外显子为靶点干扰效果最好，对A549细胞的体外恶性增殖有明显的影响。
- 李伟英汪惠赖百塘杨学惠张春彦
- 关键词：环氧化酶-2基因表达RNA干扰恶性增殖
- 突变体富集PCR法检测非小细胞肺癌病理组织EGFR基因突变被引量：1
- 2008年
- 目的建立突变体富集PCR法榆测非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。方法选取55例细支气管肺泡癌和59例非小细胞肺癌病理组织蜡块，提取基因组DNA，采用不同的突变体富集PCR法（PCR—PAGE和PCR—RLFP）检测EGFR基因常见的19和21外显子突变，并经过直接测序验证。结果在59例非小细胞肺癌中共检测出EGFR基因突变22例，突变率为37．3％（22／59）。55例细支气管肺泡癌中共检测出24例基因突变，突变率为43．6％（24／55）。经直接测序验证，EGFR19外显予有3种类型缺失突变。EGFR21外显子的错义突变为L858R。结论突变体富集PCR法准确、快速、经济，便于临床筛查非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。
- 张新勇岳文涛吴羽华徐丽焱张春彦唐俊舫李雪冰刘赞李明智
- 关键词：表皮生长因子受体基因突变
- Si-10靶点对不同COX-2蛋白表达状态肺癌细胞体外恶性增殖的影响
- 2012年
- 目的研究si-10靶点对不同环氧化酶-2（COX-2）蛋白表达状态肺癌细胞干扰效果及对肺癌细胞恶性增殖的影响。方法将psi-10及空载体（pEGFP）分别转染到不同COX-2表达状态的肺癌细胞，建立转染细胞株。采用反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹方法检测COX-2表达水平的变化。通过细胞生长曲线、集落形成验研究这-靶点对肺癌细胞体外恶性增殖的影响。结果转染后24、48和72h，转守载体的细胞均有绿色荧光表达，转染psi-10的801D、A549和LTEP-A2细胞均未观察到绿色荧光。在A549和IJTEP-A2细胞中COX-2表达均受到抑制，但抑制效果不同，与A549细胞比较si-10对LTEP-A2细胞COX-2表达抑制更为明显。与其母系比较，LTEP-A2-10和A549-10细胞COX-2mRNA表达量分别降低64．2％和61．2％；COX-2蛋白表达量分别降低60．2％和56．2％。LTEP-A2-10和A549-10细胞生长明显减慢，集落形成率减少。与A549-10细胞比较，LTEP-A2-10细胞生长更慢，集落形成率更低，集落更小。si-10靶点对COX-2不表达的801D细胞生长没有抑制作用。结论si10对不同COX-2基因表达的肺癌细胞有不同的干扰效果，而不同干扰的效果对细胞的恶性增殖有着不同的抑制作用。
- 李伟英汪惠赖百塘杨学惠张春彦
- 关键词：肺肿瘤逆转录聚合酶链反应印迹法
- 非小细胞肺癌患者中Survivin抗体的临床意义及诊断价值
- 2012年
- 背景与目的在世界范围内，恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的主要原因，且其发病率和死亡率居高不下。随着人们对肿瘤标志物研究的不断深入，肿瘤相关的自身抗体成为了研究热点。肺癌患者血清中Survivin自身抗体的临床意义目前还存在争议。本研究旨在探讨Survivin自身抗体在非小细胞肺癌患者血清中可能的临床应用价值。方法采用RT-PCR方法获得SurvivincDNA，构建原核表达载体pET30a（＋）／Survivin，亲和层析方法纯化蛋白，SDS—PAGE电冰及Westernblot鉴定，建立基于Survivin融合蛋白的间接ELISA方法，对89例健康志愿者、215例非小细胞肺癌患者以及20例肺部良性疾病患者的血清样本进行检测。结果重组Survivin融合蛋白在BL21（DE3）中以包涵体形式高效表达，间接ELISA方法检测Survivin自身抗体在非小细胞肺癌患者血清中的阳性率为19．5％，特异性为88．9％，Survivin自身抗体与非小细胞肺癌患者的肿瘤大小、远处转移间存在相关性（P〈0．05），Survivin自身抗体与CEA在非小细胞肺癌患者中联合检测的阳性率明显高于CEA与NSE、SCC、CYFRA、ProGRP联合检测的阳性率，这大大提高了非小细胞肺癌检测的敏感性。结论本研究成功构建原核表达载体pET30a（＋）／Survivin，并建立检测Survivin自身抗体的间接ELISA方法，Survivin自身抗体与肺癌肿瘤大小、远处转移间的相关性及在非小细胞肺癌患者联合检测中的重要作用，为Survivin自身抗体在肺癌中的临床应用提供了线索和依据。
- 马丽岳文涛张丽娜王玥张春彦杨学惠
- 关键词：原核表达肺肿瘤间接ELISA
- EGFR基因突变与酪氨酸激酶抑制剂疗效及预后之间的关系被引量：1
- 2008年
- 背景与目的已有的研究表明:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路在非小细胞肺癌的发生和发展中起重要作用。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)是目前非小细胞肺癌(NSCLC)治疗的热点。研究表明,EGFR基因突变与TKIs的疗效及预后相关。本研究旨在了解EGFR基因突变与两种酪氨酸激酶抑制剂疗效及预后的相关性。方法共收集了34例接受gefitinib单药治疗和25例接受erlotinib单药治疗的晚期NSCLC患者的病理组织蜡块及相关临床资料。用PCR-PAGE检测EGFR19外显子突变,PCR-RFLP检测EGFR21外显子突变,均用直接测序进行验证。结合临床进行分析。结果59例NSCLC标本中共检测出22例标本中有EGFR基因突变,突变率为37.3%。EGFR基因突变率在女性、腺癌、不吸烟患者中高(P<0.05)。有EGFR基因突变的患者接受酪氨酸激酶抑制剂治疗的有效率高于无突变患者(50%vs18.9%,P<0.05),疾病控制率高于无突变患者(86.4%vs54.1%,P<0.05)。有EGFR基因突变的患者的疾病进展时间和总生存期均高于无突变患者,但是没有统计学差异(P>0.05)。结论EGFR基因突变在女性、腺癌和不吸烟者中发生率高。有EGFR基因突变的晚期NSCLC接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的有效率和疾病控制率高于无EGFR基因突变者。
- 张新勇徐丽艳汪惠朱允中刘喆岳文涛唐俊舫武玮刘赞吴羽华张春彦石远凯王孟昭史鹤玲李明智孟弃逸郭丽丽王敬慧李雪冰
- 关键词：肺肿瘤表皮生长因子受体基因突变酪氨酸蛋白激酶
- 干扰COX-2基因表达对人肺腺癌A2细胞体外恶性增殖的影响被引量：2
- 2009年
- 背景与目的COX-2在多种肿瘤组织中高表达,参与了肿瘤的发生发展,RNA干扰(RNAi)技术是一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段。本研究应用RNAi技术研究干扰COX-2基因表达的抑制效果及抑制COX-2基因表达对A2细胞体外恶性增殖的影响。方法以COX-2为靶点,构建3个带有人U6启动子的COX-2小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)表达载体。用脂质体lipofectamine介导,分别将3个siRNA表达载体及空载体转染到COX-2表达阳性的A2细胞,建立转染细胞株。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测COX-2表达水平的变化。通过细胞生长曲线、集落形成试验研究干扰COX-2基因表达对A2细胞体外增殖的影响。结果经过PCR扩增、内切酶鉴定、DNA测序和BLAST比对证实3个siRNA和U6启动子序列正确并准确克隆到pEGFP载体。转染细胞株分别命名为A2-3、A2-7、A2-10和A2-p。转染后24h、48h、72h,A2-p细胞均有绿色荧光表达,而A2-3、A2-7、A2-10细胞均未观察到绿色荧光。RT-PCR和Western blot结果显示,3个siRNA表达载体均发挥作用,COX-2表达受到抑制,与A2细胞比较,A2-3、A2-7、A2-10细胞的COX-2 mRNA表达量分别降低15.6%、20.4%和64.2%,COX-2蛋白表达量分别降低23.7%、36.7%和60.2%。细胞生长曲线、集落形成试验的结果显示,A2-10细胞生长减慢,集落形成率减少,而A2-3和A2-7细胞生长没有明显的改变。结论应用RNAi技术熄灭COX-2基因表达对A2细胞的体外恶性增殖有明显的抑制作用。
- 李伟英汪惠赖百塘杨学惠张春彦
- 关键词：CYCLOOXYGENASE-2RNA干扰体外肺肿瘤
- EGFR基因突变与酪氨酸激酶抑制剂疗效及预后之间的关系被引量：8
- 2008年
- 背景与目的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路在非小细胞肺癌的发生和发展中起重要作用。EGFR酪氟酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）是目前非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的热点。研究表明，EGFR基因突变与TKIs的疗效及预后相关。本研究旨在了解EGFR基因突变与两种酪氨酸激酶抑制剂疗效及预后的相关性。方法共收集了34例接受gefitinib单药治疗和25例接受erlotinib单药治疗的晚期NSCLC患者的病理组织蜡块及相关临床资料。用PCR-PAGE检测EGFR199b显子突变，PCR＊RFLP检测EGFR21外显子突变，均用直接测序进行验证。结合临床进行分析。结果59例NSCLC标本中共检测出22例标本中有EGFR基因突变，突变率为37．3％。EGFR基因突变率在女性、腺癌、不吸烟患者中高（P〈0．05）。有EGFR基因突变的患者接受酪氨酸激酶抑制剂治疗的有效率高于无突变患者（50％vs18．9％，P〈0．05），疾病控制率高于无突变患者（86．4％vs54．1％，P〈0．05）。有EGFR基因突变的患者的疾病进展时间和总生存期均高于无突变患者，但是没有统计学差异（P〉0.05）。结论EGFR基因突变在女性、腺癌和不吸烟者中发生率高。有EGFR基因突变的晚期NSCLC接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的有效率和疾病控制率高于无EGFR基因突变者。
- 张新勇徐丽艳汪惠朱允中刘喆岳文涛唐俊舫武玮刘赞吴羽华张春彦
- 关键词：肺肿瘤表皮生长因子受体基因突变酪氨酸蛋白激酶
- 慢病毒介导ABCC4基因沉默A549细胞株的建立
- 2011年
- 目的ABCC4是一种多药耐药相关蛋白，其在肿瘤中的具体功能尚未研究清楚。为了探讨ABCC4在肿瘤细胞中的功能，本文通过慢病毒载体介导ABCC4 shRNA感染A549细胞，建立ABCC4基因沉默细胞株。方法通过慢病毒介导将ABCC4shRNA序列转入A549细胞，构建ABCC4 RNAi细胞株，然后在荧光显微镜下观察GFP在细胞中的表达情况，采用real—time PCR方法检测ABCC4基因在细胞中的表达水平。结果85％以上的转染细胞有荧光表达。real-time PCR结果显示应用RNAi技术成功使细胞系A549中ABCC4基因的表达受到抑制。结论利用慢病毒载体成功构建ABCC4基因沉默细胞。
- 张春彦王玥赵晓婷岳文涛
- 关键词：慢病毒基因沉默绿色荧光蛋白
- p53C末端356～393氨基酸对人肺癌细胞恶性表型的影响被引量：8
- 2003年
- 目的 研究去除C末端 3 56～ 3 93氨基酸p53对人肺癌细胞恶性增殖抑制的影响。方法利用DNA重组技术 ,构建去掉C末端 3 56～ 3 93区 3 7个氨基酸残基p53和全长p53真核细胞表达质粒[pEGFP p53 (del) ,pEGFP p53 ]。p53缺失和突变的人肺癌细胞系 80 1D为受体细胞 ,lipofectin介导质粒转染细胞。G418筛选 ,建立转染克隆细胞系。以PCR、荧光显微镜检查外源基因的表达 ;以集落形成和裸鼠移植瘤试验检测细胞体内外恶性增殖能力 ;以移植瘤或接种部位细胞团印片检查荧光蛋白表达。结果 建立了转染克隆细胞系pEGFP p53 80 1D、pEGFP p53 (del) 80 1D和pEGFP 80 1D ,证明有外源p53基因存在和外源绿色荧光蛋白基因表达。pEGFP p53 (del) 80 1D体外集落形成抑制率为 99.6% ,pEGFP p53 80 1D为 81.1% ,pEGFP p53 (del) 80 1D细胞恶性增殖能力明显低于pEGFP p53 80 1D (P <0 .0 1)。pEGFP p53 (del) 80 1D形成的少数集落也有外源p53基因和绿色荧光蛋白表达。裸鼠移植瘤试验显示 ,对照组 80 1D和pEGFP 80 1D移植瘤为阳性 (4/ 4,4/ 4) ,pEGFP p53 (del) 80 1D和pEGFP p53 80 1D移植瘤为阴性 ,接种细胞部位仍有残留细胞团存在 ,有少数表达荧光蛋白的活细胞。结论去除C末端 3 56～ 3 93氨基酸的p53 。
- 汪蕙李金照赖百塘杨学惠张春彦岳文涛湛秀萍
- 关键词：P53蛋白肿瘤异质性氨基酸
