夏添
- 作品数：5 被引量：5H指数：2
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- 条件培养基抑制L-抗坏血酸钠介导的小鼠黑色素瘤细胞凋亡
- 2012年
- 目的探讨肿瘤细胞B16F10通过自分泌对抗由L-抗坏血酸钠(VitCNa)介导的凋亡作用。方法常规在75 cm^2培养瓶中培养小鼠黑色素瘤细胞B16F10,待细胞长至90%～95%融合时吸取原DMEM/高糖培养液,用PBS反复清洗后加入无血清的DMEM/高糖10ml在培养箱中培养6～8 h,收集培养液用2500 r/min离心5min后上清用0.22μm滤器过滤,-20℃保存备用,在6孔板中每孔接种1×10~6 B16F10,常规培养24h后,实验组每孔加入2ml条件培养液(含有10%胎牛血清),对照组用普通培养液,两组均用10 mmol/L VitC Na促凋亡,分别在3、6、24 h观察细胞凋亡情况,hoechst染核,收集细胞免疫荧光检测caspase3和TUNEL、RT-PCR检测Bcl2表达。进而分离出条件培养液中相对分子质量大于5 000和小于5 000成分,分别煮沸,用蛋白酶K灭活后对B16F10促凋亡。结果发现条件培养基能够抑制VitC Na介导的小鼠黑色素瘤细胞B16F10凋亡,抗凋亡成分小于5 000,且不能被煮沸和蛋白酶K灭活,提示其是小分子抗凋亡物质。结论 B16F10可以分泌出拮抗细胞凋亡的小分子物质。
- 杨旭辉夏添余伟华卢晓芳项鹏何峰
- 关键词：黑色素瘤细胞凋亡条件培养基
- 慢病毒介导shRNA沉默巢蛋白表达对人黑色素瘤细胞转移特性的影响被引量：3
- 2012年
- 目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默黑色素瘤细胞株UACC903巢蛋白(nestin)的表达,研究其对黑色素瘤细胞转移能力的影响。方法以人nestin mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒基因PLL3.7作为质粒载体,构建靶向人nestin的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,分别感染UACC903细胞并流式分选获得高纯度的nestin干扰或对照组细胞。应用RT-PCR、免疫荧光及Western blotting检测不同组别nestin表达的变化。分别用Transwell侵袭试验检测跨膜细胞的数量评估各组黑色素瘤细胞的侵袭能力,划痕法检测迁移能力改变。光镜观察各组细胞形态变化,免疫荧光检测E-cadherin、N-cadherin和β-catenin在不同组别的表达变化。结果成功构建nestin shRNA慢病毒载体nestin-RNAi-LV。RT-PCR及免疫荧光结果显示干扰组UACC903细胞nestin mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低。nestin下调的UACC903细胞黏附、侵袭及迁移能力下降(P<0.05)。结论慢病毒介导的shRNA能有效地静默食管癌细胞nestin基因的表达,能抑制黑色素瘤细胞UACC903迁移。
- 杨旭辉夏添余伟华卢晓芳项鹏何峰
- 关键词：人黑色素瘤巢蛋白
- Nestin表达下调对人黑色素瘤细胞系UACC903增殖、凋亡和迁移的影响
- 巢蛋白(Nestin)是中间丝蛋白家族成员，最初在大鼠中枢神经系统神经前体细胞中被克隆，也广泛表达于神经系统外的多种胚胎组织前体细胞[1]。在成体组织中，Nestin仅在未完全分化，保持一定增殖能力的细胞中表达;组织损伤...
- 夏添
- 关键词：黑色素瘤细胞增殖细胞迁移
- 文献传递
- Nestin特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选被引量：2
- 2012年
- 目的构建人nestin基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制nestin基因表达对人黑色素瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法分别用30、50、80 nmol/L干扰或80 nmol/L对照siRNA转染人黑色素瘤细胞株UACC903,48 h后用免疫荧光、RT-PCR和Western-blot鉴定nestin基因表达并筛选有效的序列,用有效或对照组序列的正义链和反义链,通过酶切、连接、转化和筛选,获得长期下调人nestin基因表达的慢病毒载体,并包装慢病毒感染人UACC903细胞,免疫组化和Western-blot鉴定干扰有效,以此获取nestin表达下调的UACC903细胞株。结果重组质粒成功转化高感受态大肠杆菌,经XhoⅠ和HPAⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。干扰组或对照组慢病毒感染UACC903细胞后与对照组比较,干扰组mRNA和蛋白表达明显降低。结论成功构建了针对人nestin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制nestin基因的表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。
- 杨旭辉夏添余伟华钟跃思项鹏何峰
- 关键词：RNAINESTIN黑色素瘤细胞
- 通过干扰巢蛋白表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法
- 本发明涉及一种通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法。本发明所述的方法包括以下步骤：A.提供肿瘤的特定细胞株和培养条件；B.鉴定上述肿瘤细胞株表达巢蛋白的表达；C.加入待筛选的药物；以及D.培养...
- 项鹏杨旭辉夏添
- 文献传递
