薛奎晶
- 作品数：2 被引量：11H指数：2
- 供职机构：沈阳药科大学生命科学与生物制药学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- Man_5GlcNAc_2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建被引量：8
- 2011年
- 蛋白的糖基化对蛋白的活性、高级结构及功能都有重要的影响。酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白,而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化,获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基础上,通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白,并通过DSA-FACE(基于DNA测序仪的荧光辅助糖电泳)分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基结构,发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时,毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。
- 杨晓鹏刘波宋淼巩新唱韶红薛奎晶吴军
- 关键词：糖基化毕赤酵母
- 一种两步基因同源重组敲除酵母靶标蛋白基因的方法被引量：3
- 2010年
- 目的:建立一种在代谢工程改造的毕赤酵母菌中高效敲除靶标蛋白基因的方法。方法:构建敲除载体,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因为靶基因,以尿嘧啶合成关键酶URA3基因为营养缺陷型筛选标记,第一步重组利用ura3正筛选获得敲除载体在酵母染色体中的定点整合,第二步通过5-氟乳清酸(5-FOA)筛选到表型为ura3-的克隆,ura3基因被剔除的同时,目的基因GM-CSF也随之丢失,实现第二次重组;利用基因组PCR和蛋白电泳进行鉴定。结果:通过两步基因同源重组,敲除了毕赤酵母GJK01的报告蛋白GM-CSF的编码基因388 bp,PCR结果显示该基因已完全丢失,SDS-PAGE分析无GM-CSF表达。结论:仅通过2周时间的筛选、鉴定,在毕赤酵母GJK01中敲除了报告蛋白GM-CSF的编码基因,突变菌株的阳性率达到50%,最终建立了以URA3为筛选标记的两步基因同源重组敲除目的基因的方法。
- 薛奎晶刘波唱韶红巩新徐威吴军
- 关键词：毕赤酵母粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因敲除同源重组
