宋淼
- 作品数：6 被引量：32H指数：3
- 供职机构：沈阳药科大学生命科学与生物制药学院更多>>
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- 相关领域：生物学更多>>
- Man_5GlcNAc_2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建被引量：8
- 2011年
- 蛋白的糖基化对蛋白的活性、高级结构及功能都有重要的影响。酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白,而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化,获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基础上,通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白,并通过DSA-FACE(基于DNA测序仪的荧光辅助糖电泳)分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基结构,发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时,毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。
- 杨晓鹏刘波宋淼巩新唱韶红薛奎晶吴军
- 关键词：糖基化毕赤酵母
- 抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的高效表达及其产物分析被引量：3
- 2009年
- 目的:在乳酸克鲁维酵母中实现抗HER2人源化单克隆抗体的表达。方法:应用PCR扩增抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链基因,将扩增产物分别克隆入酵母表达载体pYES2/ochI和pPICZαA/ura3,经限制性内切酶以及DNA序列测定分析插入片段正确后,将重组质粒转化乳酸克鲁维酵母(Δura3)。转化子用半乳糖诱导,经间接ELISA和Western blot鉴定所表达产物的产量以及和抗原结合的活性。结果:构建了抗HER2人源化单克隆抗体轻、重链表达载体pYES2/ochI+αL和pPICZαA/ura3+αH,摇瓶培养表达产量可达(120±20)mg/L;经还原和非还原SDS-PAGE分析,抗体的轻、重链能够通过分子间二硫键正确装配;所表达抗体可与HER2胞外域特异性结合。结论:实现抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达,具有与其抗原特异性结合的能力。
- 汪丽娜刘波巩新唱韶红王凌雪宋淼徐威吴军
- 关键词：乳酸克鲁维酵母高效分泌表达
- α-1,2-甘露糖苷酶在毕赤酵母突变菌株中的克隆表达
- 酵母表达系统已经被广泛应用于多种重组蛋白的表达。酵母对蛋白的糖基化修饰过程不同于哺乳动物,其特点为产生高甘露糖型糖基且易发生过度糖基化。
本研究是毕赤酵母糖基化改造工作中的一个重要组成部分。目的是通过引入α-1,2...
- 宋淼
- 关键词：毕赤酵母突变菌株基因克隆基因表达
- 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在毕赤酵母中的表达及活性分析被引量：3
- 2008年
- 目的:利用毕赤酵母野生型菌株GS115(his4)和突变型菌株GJK01(ura3,ade1,arg4,his4,och1)表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF),并对其活性及糖基修饰情况进行比较。方法:用PCR技术扩增目的基因,引入XhoⅠ、NotⅠ双酶切位点,构建pPIC9-hGM-CSF表达载体,电击转化毕赤酵母GS115和GJK01感受态细胞,得到工程菌;经甲醇诱导,对其表达产物进行糖基分析和生物学活性分析。结果:hGM-CSF在野生型菌株GS115和突变型菌株GJK01中均得到表达,其中野生菌表达的为过度糖基化的糖蛋白,而突变型菌株表达的为低糖化的糖蛋白,且二者均可刺激TF-1细胞的生长,比活性分别为9.79×105和2.21×105U/mL。结论:利用酵母工程菌表达了低糖化的重组hGM-CSF,为其药物研究提供了新的思路,也为酵母的糖基工程改造提供了良好的糖蛋白模型。
- 宋淼刘波王越刘党生吴军
- 关键词：毕赤酵母N-糖基化生物活性
- 一种利用DSA-FACE分析寡糖链的方法被引量：3
- 2008年
- 目的:优化糖链结构分析方法,满足高通量、高灵敏度和快速分析糖基结构的要求。方法:基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DSA-FACE),将糖蛋白经过糖苷酶酶切获得糖链,并与荧光标记物8-氨基芘基-1,3,6-三磺酸(APTS)进行衍生化反应,标记样品经过Sephadex-G10、HPLC纯化后,用DNA3100测序仪电泳分离,用Genescan3.7软件进行数据分析。结果:利用DSA-FACE技术分析了标准品Man5GlcNAc2和Gal2GlcNAc2Man3GlcNac2,并得到糖蛋白牛核糖核酸酶B的5种N-糖基结构(Man5～9GlcNAc2)。结论:DSA-FACE是分析糖基结构的有效技术手段,能够实现对糖基结构的高通量、高灵敏度和快速分析。
- 刘波宋淼巩新唱韶红王凌雪杨依丽汪丽娜马清钧吴军
- 关键词：糖蛋白
- α-1,6-甘露糖转移酶基因敲除的毕赤酵母菌株构建及其用于融合蛋白HSA/GM-CSF表达的研究被引量：19
- 2007年
- 酵母对蛋白的糖基化修饰过程不同于哺乳动物,其特点为产生高甘露糖型糖基且易发生过度糖基化。本研究通过两步基因重组敲除目标基因的方法成功敲除了毕赤酵母中的α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)基因,获得了och1敲除的菌株。以此为基础,构建了高效表达人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(HSA/GM-CSF)的工程酵母,与野生型毕赤酵母表达的过度糖基化HSA/GM-CSF不同,och1敲除菌表达的该融合蛋白糖基化程度明显降低,这为该融合蛋白的开发提供了重要基础。och1敲除菌株的构建不仅提供了一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,而且为进一步的酵母糖基工程改造提供了基础。
- 王越巩新唱韶红刘波宋淼黄海华吴军
- 关键词：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子人血清白蛋白毕赤酵母
