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高建恩: 作品数：13 被引量：25H指数：3; 供职机构：北京医科大学人民医院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金美国中华医学基金会项目美国中华医学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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EBV转化B淋巴细胞中丙型肝炎病毒抗原表达的免疫组化研究被引量：2: 2001年; 观察丙型肝炎患者外周血单个核细胞 (PBMC)体外转化培养后其中是否仍有丙型肝炎病毒 (HCV)存在。用EB病毒感染患者HCV阳性PBMC并使其转化 ,获得永生化B细胞 (EBVTB)。而后 ,用套式RT -PCR检测培养细胞和上清中的HCVRNA ,用免疫组化SP法观察HCV抗原在细胞中的表达。HCV在传代细胞中持续存在 ,而培养细胞中的HCVRNA负链和培养上清中的HCV间断阳性。免疫组化发现HCVNS3、NS5和C抗原分布于胞浆、细胞膜和核膜周围也可见阳性着色 ,细胞核阴性。HCV可以在体外EB病毒转化B细胞系中较长时间存在和复制。; 程计林耿直仝文斌范涛高建恩马文彬冯百芳; 关键词：B淋巴细胞 EBV 抗原

丙型肝炎病毒NS3蛋白真核表达载体的构建及其基因免疫研究被引量：1: 1999年; 基因免疫是指将编码特异抗原的目的基因重组表达载体直接接种到宿主组织内，在体内表达基因产物，进而激发宿主产生特异性免疫反应。自１９９０年首次报道发现基因免疫以来，这一新的免疫技术已经在基础免疫学研究和疫苗研制等许多领域得到广泛应用。对许多疾病（如流感）...; 范涛高建恩陶其敏; 关键词：丙型肝炎病毒 NS3蛋白真核表达载体基因免疫

丙型肝炎病毒E2基因激发小鼠细胞免疫的实验研究: 2000年; 目的 :研究丙型肝炎病毒E2基因接种能否诱导机体产生细胞免疫以及乙型肝炎病毒preS基因对其诱导细胞免疫能力的影响。方法 :以BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞株 (SP2 /O)为宿主细胞 ,建立表达丙肝病毒E2蛋白的靶细胞 ,将其注射于E2基因或 preS与E2融合蛋白基因免疫的小鼠腹腔 ,记录小鼠接种瘤细胞后的存活期 ,以小鼠存活期的长短作为反映基因免疫小鼠对HCVE2蛋白细胞免疫的有无或强弱的指标。结果 :靶细胞表达了相对分子质量约为 70 0 0 0的E2蛋白 ,E2基因接种小鼠的存活期长于对照组 ,单独E2基因接种组的存活期显著长于对照组 ,也长于 preS与E2融合蛋白基因免疫组。结论 :E2基因接种能诱导细胞免疫 ,但与 preS融合后 ,其诱导细胞免疫的能力会降低。; 谢尧高建恩梁庆华陶其敏; 关键词：丙型肝炎 E2基因细胞免疫

HCV E1基因序列的原核高效表达及表达产物的初步应用: 2001年; 目的　在原核表达系统中对HCVE1基因进行克隆和高效表达 ,并初步探讨表达产物在抗 HCV筛选中的作用。方法　通过RT PCR法从HCVRNA阳性的血清标本中扩增出HCVEI片段 ,并在扩增用的引物中引入克隆所需的酶切位点 ,克隆产物经XbaⅠ和EcoRⅠ酶切后 ,在T4DNA连接酶的作用下克降入经同样双酶切的原核表达载体PMS 31b中 ,并用此连接产物转化大肠埃希菌POP2 136 ,挑取具有氨苄抗性的菌落扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定 ,鉴定出的阳性菌经42℃诱导后用SDS PAGE检查其表达状况 ,并用Westernblot鉴定表达产物的特异性 ,同时用初步纯化的表达产物用ELISA法检测病人血清。结果　经SmaⅠ酶切后PCR产物被切成 144bp和 35 6bp的两个片段 ,在具有氨苄抗性的菌中提取的质粒经SmaⅠ和XbaⅠ酶切后产生了一 35 6bp的片段 ;42℃诱导后在SDS PAGE中出现了一条相对分子质量为 310 0 0的条带 ,其表达量约为 17% ,经West ernblot鉴定后在该处出现了阳性信号 ;ELISA实验显示在抗HCV阳性的血清中的阳性率约为2 9 8% (2 6 /90 ) ,而在抗HCV阴性的血清中其阳性率约为 3 9% (3/76 )。结论　通过RT PCR方法将HCVE1基因从HCVRNA阳性的血清标本中调出 ,构建了HCVE1的原核表达载体—PMS E1,其表达量为 17% ,表达产物具有良好的特异性 ,有?; 高建恩陶其敏马大龙冯百芳纪和平季颖; 关键词：丙型肝炎病毒病毒包膜蛋白质粒

丙型肝炎病毒 HCV E1区基因的真核表达载体构建及序列分析被引量：2: 1999年; 建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体，并通过对其序列分析阐明其作为基因接种的可能性。方法：经常规ＲＴ－ＰＣＲ法从ＨＣＶＲＮＡ阳性病人的血清中扩增出ＨＣＶＥ１区的基因片段，经ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶发后将其克隆到真核表达载体ＰｃＤＮＡ３中，阳性克隆经ＳｍａⅠ和ＸｂａⅠ双酶切鉴定以脱氧终止法测序，同时利用计算机软件对其推定的氨基酸序列进行分析。; 高建恩蒋栋陶其敏纪和平季颖冯百芳; 关键词：丙型肝炎病毒基因表达

丙型肝炎病毒HCV E1区基因在真核细胞中的表达及表达产物的初步应用: 2000年; 目的:建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体,并对表达产物进行鉴定,同时测定表达产物与抗HCV阳性血清的反应情况。方法:用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ从原核表达载体pMSCVE1中切下HCVE1区的基因片段,并将其克隆到真核表达载体PcDNA3.1中,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后,用磷酸钙共沉淀法将其转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中,同时利用WesternBlot方法对表达产物进行鉴定;测定表达产物与20份抗HCV阳性血清标本和10份抗HCV阴性的血清标本的反应性。结果:经酶切过夜后从原核表达载体上切下的基因片段与经过同样双酶切的真核表达载体PcDNA3.1连接,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ酶切后产生了预期大小的354bp的片段。经磷酸钙转染,产生了具有对G418抗性的细胞克隆,经WesternBlot方法用抗HCVE1区合成肽抗原的单抗检测表达产物,产生了特异的反应;并证实该表达产物与HCV患者的血清有特异反应。经WesternBlot证实在抗HCV阳性血清中有35%(7/20)可与表达产物产生特异的反应;阳性细胞经3个月传代后,仍可检测到HCVE1的表达产物。结论:此项研究所建立的能够表达HCVE1基因细胞系表达产物可与阳性血清发生特异性反应,该细胞系的建立为进一步研究抗HCVE1抗体的临床意义及进行有关HCV核酸免疫的研究创造了条件。; 高建恩陶其敏马大龙冯百芳蒋栋; 关键词：真核细胞丙型肝炎病毒基因表达

丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2～3部分基因cDNA克隆序列分析及表达: 2000年; Complementary DNA of partial HCV NS2 NS3 protein gene which encodes viral Zn 2+ dependent metalloprotease and serine protease was amplified by RT nested PCR from serum of a Chinese patient with chronic hepatitis C.The product was digested with Eco R Ⅰ/ Xba Ⅰ and cloned into pcDNA3.The nucleotide sequence was determined.Comparison of NS2 NS3 with the reported typical isolates HCV 1,HCV J,HC C2,HCV J6,HCV J8 showed as 73.72%,90.20%,91.02%,64.56%,63.37% identity in nucleotide sequence and 83.24%,92.09%,93.13%, 70.88% ,67.86% identity in amino acid sequence respectively, so the isolate could be classified as HCV genotype Ⅱ. This gene fragment was cloned into pBV220 to construct recombinant expression vector pBV220 NS2 3.It was expressed efficiently in E.coli . The cloning and expression of HCV NS2 NS3 may contribute to the investigation of the relation between structure and function of viral encoded protease.; 范涛高建恩陶其敏; 关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白

在哺乳动物细胞中稳定表达丙型肝炎病毒E2糖蛋白被引量：4: 1998年; 利用ＤＮＡ重组技术，将Ⅲ型中国株ＨＣＶＥ２／ＮＳ１基因片段插入真核表达载体，然后转染哺乳动物细胞ＮＩＨ３Ｔ３以表达Ｅ２糖蛋白．检测显示来自３月以上培养的细胞克隆中表达产物分子量为７０ｋＤ，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实该表达产物能与抗ＨＣＶ阳性血清进行特异性反应．以上表明首次在哺乳动物细胞中成功表达Ⅲ型中国株ＨＣＶ的Ｅ２糖蛋白，并建立相应的稳定表达细胞系．; 吴朝栋高建恩陶其敏; 关键词：丙型肝炎病毒包膜蛋白哺乳动物

EB病毒转化的丙型肝炎病人外周血B淋巴细胞中丙型肝炎Ⅱ型病毒持续存在的研究被引量：1: 2000年; 目的　观察丙型肝炎病人外周血B细胞长期存活状态下其中是否仍有丙型肝炎病毒(HCV)存在。方法　用EB病毒感染并使HCV阳性外周血B细胞转化 ,获得含HCV的外周血永生化B细胞 (LCL)。而后 ,每月应用套式RT PCR检测一次培养细胞和上清中的HCV RNA ,并用酶切法进行HCV基因分型 ,电镜和免疫电镜观察HCV在该细胞中存在的部位及其形态结构特征。结果　经连续 1年检测 ,HCV在传代细胞中持续存在 ,培养细胞中的HCVRNA负链和培养上清中的HCV呈间断阳性。HCV基因为Ⅱ型。电镜下病毒颗粒呈圆球型 ,双层膜结构 ,定位于胞质空泡内 ,直径多为 45～ 70nm ,个别为 110nm。结论　HCV可以在培养的EB病毒转化B细胞系中较长时间存在、复制和分泌 ,为病人外周血单个核细胞中HCV持续存在提供了又一证据 ,对于理解HCV感染慢性化机理。; 程计林陈良标仝文斌陈佩兰刘宝玲高建恩杜少才冯百芳; 关键词：丙型肝炎外周血 E-B病毒

丙型肝炎病毒NS3蛋白单克隆杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定被引量：4: 1995年; 应用国产基因工程表达的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３区抗原免疫小鼠，然后取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系ＳＰ２／０融合，筛选出４株稳定分泌抗ＨＣＶＮＳ３区蛋白单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株，分别命名为２Ｂ６，２Ｆ３，３Ｄ８，３Ｄ９，经初步研究表明这４株单抗与ＮＳ３抗原具有良好的反应性，与ＨＣＶ核心区多肽及乙型肝炎病毒表面抗原和ｅ抗原均无反应。抑制实验表明这４株抗体分别针对ＮＳ３抗原分子上的２个不同的抗原决定簇。; 高建恩郭建平纪和平季颖陶其敏; 关键词：丙型肝炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株

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