韦攀健
- 作品数：30 被引量：54H指数：4
- 供职机构：首都医科大学附属北京胸科医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 酶联免疫斑点术和流式细胞术检测γ干扰素对结核性胸膜炎的辅助诊断价值被引量：1
- 2011年
- 目的探讨胸腔积液PEMC中CD4＋T淋巴细胞分泌或产生IFN—γ的检测对结核性胸膜炎的辅助诊断价值。方法分离40例结核性胸腔积液（结核组）和30例恶性胸腔积液患者（疾病对照组）PELVIC，经克隆表达的早期分泌抗原靶6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP-10）融合蛋白（简称“E／C”）刺激后，用ELISpot检测分泌IFN—γ细胞的斑点形成细胞（SFC）数量和流式细胞术（FCM）结合胞内细胞因子染色检测产生IFN-γ细胞比率，并比较这2项指标在结核组和疾病对照组间的差异，同时评价2种方法检测IFN-γ对结核性胸膜炎的辅助诊断效能。结果PEMC经E／C刺激后用ELISpot检测结核组SFC数量为205（125-450）SFC／5×10^4PEMC，疾病对照组为5（2～18）SFC／5×10^4PEMC，两组间的差异有统计学意义（u=20．00，P〈0．01）；FCM检测结核组CD4＋T淋巴细胞产生1FN—Y细胞比率为3．27％（1．81％-7．34％），疾病对照组为0．12％（0．06％-0．46％），两组问的差异有统计学意义（U=45．00，P〈0．01）。ELISpot检测PEMC经E／C刺激后分泌IFN-γ的敏感度为92．5％（37／40）、特异度为80．0％（24／30）、阳性预测值为0．86、阴性预测值为0．89、阳性似然比为4．63、阴性似然比为0．09和准确度为87．1％；FCM检测经E／C刺激后产生IFN-γ的敏感度为87．5％（35／40）、特异度为90．0％（27／30）、阳性预测值为0．92、阴性预测值为0．84、阳性似然比为8．75、阴性似然比为o．14和准确度为88．6％。结论经E／C刺激后，用FCM和ELISpot检测CD4＋T淋巴细胞产生和分泌IFN—γ细胞的方法对结核性胸膜炎诊断的敏感度和特异度高，且对结核性胸膜炎有辅助诊断价值。
- 杜凤娇戈启萍韦攀健贾红彦邢爱英杜博平古淑香张宗德
- 关键词：胸膜免疫酶技术流式细胞术
- 一种结核杆菌融合抗原的克隆表达及活性测定被引量：2
- 2008年
- 目的进一步分析优化结核杆菌抗原优势表位,获得高特异性融合抗原,以满足研制结核病检测试剂的需要。方法用分子生物学软件分析结核杆菌四种抗原MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3的优势表位后,分别插入到pBVIL1载体中,构建表达质粒,并利用pBVIL1载体特点,将其基因连接后,进行融合表达,经纯化获得抗原,用间接ELISA法测其活性。结果各抗原优势肽段及融合抗原均获得了高效表达,融合抗原的特异性和灵敏性均高于各单一肽段。结论此融合抗原可用于研制结核病的诊断试剂。
- 宋晓国陈坤冯晓燕王国华朱翠侠李惠文韦攀健张贺秋
- 关键词：MPT64MTB8.4
- 全人源EGFR单抗的筛选和鉴定
- 2020年
- 目的:制备全人源表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体,为基于人EGFR靶点的肿瘤免疫调节治疗提供基础制剂。方法:采集110例胸部肿瘤(肺癌102例,乳腺癌8例)患者外周血,构建噬菌体单链抗体库。经噬菌体展示后筛选阳性克隆,测序并构建全长轻重链表达载体质粒,共转染HEK293。通过亲和层析获得纯化抗体,抗原抗体免疫反应测定抗体特异性和敏感性,生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术测定抗体亲和力和流式细胞技术(fluorescence activating cell sorter,FACS)检测对肿瘤细胞系EGFR结合活性。结果:成功构建肺癌单链抗体噬菌体库,抗体库库容≥108,筛选获得两株单抗,分别为BTHG17-1,BTHG17-2,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定结合抗原敏感性为10 ng/mL,亲和力在10-8 mol/L水平,两抗体结合相同表位,可特异性结合野生型EGFR和突变体EGFRvⅢ蛋白,具有结合肺癌和神经胶质瘤细胞活性。结论:获得较高亲和力全人源EGFR单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),具有EGFR(包括EGFRVⅢ)特异性,为EGFR靶点封阻和免疫导向治疗研究提供一种新抗体工具。
- 李姝萍杨斌金鑫王小珏闫卓红易玲韦攀健王和林王和林张洪涛
- 关键词：肺癌噬菌体抗体库表皮生长因子受体人源抗体
- 红色荧光蛋白和荧光素酶双表达稳定肺癌细胞系的建立被引量：1
- 2018年
- 目的 构建能稳定表达红色荧光蛋白（RFP）和萤火虫荧光素酶（Fluc）的人肺癌细胞系,为建立活体成像的人肺癌裸鼠移植瘤模型及治疗研究奠定基础.方法 构建含Fluc和RFP基因的慢病毒载体pHBLV-Fluc-RFP,转染293T细胞进行病毒包装,用获得病毒液感染人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,再用嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株,最后分别采用荧光显微镜和实时定量PCR检测稳定感染细胞中RFP和Fluc的表达.结果 成功构建了pHBLV-Fluc-RFP慢病毒载体,获得了稳定表达Fluc和RFP的A549、H1975和K562细胞.荧光显微镜下可观测到3种稳定感染细胞中均有红色荧光.实时定量PCR检测结果显示,3种稳定感染细胞中Fluc基因的相对表达量远远高于对应的野生型细胞,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）.结论 获得的RFP和Fluc双表达人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,为人肺癌细胞免疫缺陷小鼠模型的活体成像提供了新荧光配色细胞模型.
- 高鑫杨斌韦攀健王小珏张洪涛
- 关键词：红色荧光蛋白萤火虫荧光素酶慢病毒载体
- EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达被引量：1
- 2020年
- 目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10 -10 mol/L),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。
- 李姝萍王小珏杨斌王和林王和林闫卓红易玲韦攀健郝建清张洪涛
- 制备两种p53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达
- 2010年
- 背景与目的p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53C-末端负调控序列的作用。本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺病毒,并采用流式细胞仪散点图(flow cytometry scatter plot,FCM)检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达。方法利用pAdEasy-Track载体系统,构建两种p53重组质粒并在细菌中产生重组体,转染L293细胞产生三种重组腺病毒,测序证明。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞,FCM scatter plot检测其GFP表达。结果测序证明重组腺病毒:Ad-p53(del)缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区,Ad-p53(wtp)无p53碱基缺失。Ad-(empty carrier)无p53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端p53和全长p53的两种重组腺病毒:Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)及空载体Ad-(empty carrier)。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠,可定量外源GFP表达为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。
- 汪惠赖百塘李伟英杨学惠张春燕韦攀健李金照
- 关键词：野生型P53重组腺病毒
- 一种可拉伸式针灸用漏斗套管
- 本实用新型涉及一种可拉伸式针灸用漏斗套管，其包括外管(1)和内管(2)，其特征在于：所述外管(1)套设在内管(2)上；所述外管(1)上固定连接有漏斗式开口(3)，所述外管(1)和内管(2)套设后形成腔体(6)，所述腔体(...
- 潘元明韦攀健李威
- 天然调节T细胞与结核病免疫病理关联
- 2010年
- 目的检测调节性T细胞（Tr）在结核病病人是否增高，确证Tr与结核免疫病理的关联性，为Tr功能研究提供疾病模型。方法流式细胞术（FACS）分选CD3＋CD4＋T及CD3＋CD8＋T等主要淋巴细胞亚群，通过RT—PCR测定Foxp3基因在正常和结核病病人T细胞亚群中的表达，FACS多色分析Foxp3T细胞在CD4＋CD25＋细胞群体中的分布，累积病例分析Tr细胞在外周血扩增情况，免疫组化方法分析Tr在结核病理的浸润，结合临床资料分析Tr数量的改变与结核病的关联性。结果Foxp3基因在正常和结核病病人CD3＋CD4＋T细胞中特异性扩增，FACS分析表明Foxp3F要表达于CD4＋CD25＋。“亚群中，占CD4＋CD25highT细胞的80％以上，以CD4＋CD25highFoxp3＋三联标志检测40例正常与51例活动性结核病病人外周血Tr占CD4＋T细胞比例分别为（0．23±0．20）％和（1．01±1．00）％，结核病病人较正常人高4．4倍，Tr在结核病明显扩增（P〈0．01），结核病理组织中有高频率Foxp3＋细胞浸润。Tr扩增与结核病有效治疗和预后的关联性有深入探讨价值。结论Tr细胞在结核病病人增高，并与结核免疫病理损伤相关，结核病可作为Tr细胞功能研究的疾病模型。
- 赵雁林王敬张海青易玲李惠文韦攀健赵丹王小珏郑小芳张洪涛
- 关键词：天然调节性T细胞结核病免疫病理
- 一株针对人EGFR的单链抗体克隆与哺乳细胞表达被引量：1
- 2018年
- 目的：制备特异性抗人表皮生长因子受体（EGFR）的单链抗体（sc Fv）,鉴定其生物学活性,为进一步研究基于单链抗体的免疫治疗奠定基础。方法：从分泌抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞系提取总RNA,利用5’RACE技术扩增轻链和重链可变区（VL、VH）基因,构建具有VL、VH基因的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到真核细胞表达载体pc DNA3.1中进行表达和鉴定。ELISA鉴定单链抗体对抗原的特异性;Fortebio检测抗原抗体间的亲和力,流式细胞术检测单链抗体结合肺癌细胞系天然EGFR的功能活性。结果：获得唯一的轻重链可变区序列VL、VH,成功构建EGFR-sc Fv,特异性与天然EGFR蛋白结合,亲和力达3.22×10-9mol/L。结论：成功构建了抗人EGFR单链抗体,为肺癌免疫导向治疗研究奠定了基础。
- 高鑫韦攀健闫卓红易玲王小珏杨斌张洪涛
- 关键词：表皮生长因子受体单链抗体
- SPLUNC1-Ig融合蛋白在CHO细胞中的稳定表达及活性初步分析
- 2010年
- 目的 构建短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）-Ig融合蛋白表达体系并初步分析其活性.方法 在质粒PGEM-T easy-SPLUNC1基础上联合应用大引物法和巢式PCR实现目的序列147位碱基的定点突变,亚克隆于表达载体PDH3,构建PDH3-SPLUNC1的表达质粒.稳定转染CHO/dhfr-细胞完成SPLUNC1-Ig融合蛋白的表达,并在氨甲喋呤（MTX）加压下筛选出稳定表达的细胞株,应用ELISA检测蛋白表达的水平.利用蛋白A亲和层析系统纯化获得的SPLUNC1-Ig融合蛋白,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹进行鉴定,经ELISA、Western免疫印迹分析SPLUNC1-Ig融合蛋白的特异性和活性.结果 经酶切及测序结果证实预定位点已突变,琼脂糖凝胶电泳出现大小为768 bp的目的条带;测序发现SPLUNC1基因的147位碱基A均已突变成C,证实PDH3-SPLUNC1表达质粒构建成功.RT-PCR扩增出768 bp大小的SPLUNC1基因.ELISA检测CHO/dhfr-细胞上清表明SPLUNC1-Ig融合蛋白在3个月内稳定表达,水平与时间的延长无关.经亲和层析获得SPLUNC1-Ig融合蛋白,SDS-PAGE电泳可见相对分子质量约52 500大小的条带.Western免疫印迹也在45 000与66 200之间出现与预测位置相符的特异目的条带.SPLUNC1-Ig融合蛋白浓度为0.39 mg/L时与脂多糖结合活性明显高于阴性对照,6.25 mg/L时与脂多糖结合的A450值基本达到平台期.Western免疫印迹也显示未变性的脂多糖可与SPLUNC1-Ig融合蛋白结合,而变性后却不能与之结合.结论 建立了非切胶纯化的定点突变方法,顺利实现了表达质粒的构建.成功构建SPLUNC1-Ig融合蛋白表达体系,其分泌的目的蛋白具有蛋白的天然结构和体外活性.
- 薛君力赵雁林易玲王小珏李惠文韦攀健郑小芳张洪涛
- 关键词：CHO细胞脂多糖类免疫活性
